MAP18參與了脫落酸調控的擬南芥氣孔關閉及根生長

劉廣志　陳炳佑　侍福梅

摘要：以擬南芥野生型、GFP-α-tubulin-6轉基因擬南芥及微管結合蛋白MAP18相關突變體為材料，利用藥理學試驗及激光掃描共聚焦顯微技術研究了在脫落酸（ABA）誘導葉片氣孔關閉過程中保衛細胞微管骨架的動態變化、根生長情況及其可能的調控因子。結果表明，微管結合蛋白MAP18過表達擬南芥OE的葉片氣孔關閉現象敏感，MAP18 RNAi沉默株R18現象相對不敏感。外源ABA抑制擬南芥幼苗初生根的生長試驗中，突變體OE根伸長減慢的現象顯著，伸長速率由0.60 cm/d降低至0.12 cm/d，未處理時WT、map18的伸長速率都要低于OE的伸長速率，而用5 μmol/L ABA處理之后，WT、map18的伸長速率高于OE的伸長速率。在此基礎上研究了參與其中的作用因子，推測MAP18通過影響微管的動態重組參與到ABA誘導擬南芥氣孔關閉和根伸長的生理過程。

關鍵詞：MAP18；擬南芥；脫落酸；氣孔；幼根；微管結合蛋白

中圖分類號： Q945文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2015）11-0055-03

收稿日期：2014-12-23

基金項目：國家自然科學基金（編號：31240035）；山東省自然科學基金（編號：ZR2010CQ002）。

作者簡介：劉廣志（1989—），男，山東聊城人，碩士研究生，研究方向為生物化學與分子生物學。 E-mail：liuguangzhi_568@163.com。

通信作者：侍福梅，博士，副教授，從事模式植物及重要農作物環境應答的信號轉導研究。E-mail： shifumei@lcu.edu.cn。脫落酸（abscisic acid，ABA）是一種重要植物激素，有多種生物功能，在氣孔關閉和開放[1]、側根發生[2]、初生根伸長生長[3]過程中有重要作用。微管是植物細胞骨架成分之一，在維持細胞形態與結構、參與胞內物質運輸、信號轉導[4-5]上有重要作用。現在越來越多的證據表明微管骨架的組裝與解聚在氣孔運動中發揮著作用[5-9]，并有研究報道保衛細胞微管骨架直接參與調節氣孔運動[10]，G蛋白作為調節因子參與到氣孔運動中[11]，是否還有其他蛋白也參與其中？

微管是由微管蛋白組成，而微管蛋白在結合蛋白的影響下，進行著微管的組裝與解聚，微管結合蛋白中的MAP18是一種植物微管的去穩定因子，可以影響周質微管的排列方式，進而影響細胞的生長[12]。MAP18在花粉的生長中起著作用[13]，并且有研究表明ABA可能通過MAP18共同調控花粉的生長[14]。本研究以擬南芥為研究對象，探討研究微管骨架在ABA誘導氣孔關閉過程中的動態變化、根伸長情況及MAP18在其中的作用，為進一步了解ABA影響氣孔運動及根生長發育的生理過程提供很多信息。

1材料與方法

1.1材料

供試植物為擬南芥野生型擬南芥WT、GFP-α-tubulin-6轉基因擬南芥及微管結合蛋白MAP18相關突變體：MAP18過表達植株OE、MAP18沉默株R18和MAP18 T-DNA 插入突變株map18。

1.2方法

1.2.1擬南芥的種植用75%乙醇處理野生型擬南芥、GFP-α-tubulin-6 轉基因擬南芥和相關突變型擬南芥種子2 min，0.5 %次氯酸鈉浸泡8 min，無菌水漂洗4～6次，用移液槍點播在MS培養基上，4 ℃放置3 d，置于溫度為（21±2） ℃、光-暗周期為14 h-10 h的光照培養箱中培養。

1.2.2微管骨架動態排布的觀察MS培養基中生長7 d的GFP-α-tubulin轉基因擬南芥幼苗分別在0、1.0、2.5、5.0 μmol/L ABA溶液中浸泡30 min后，每隔15 min在激光共聚焦顯微鏡（奧林巴斯，FluoView FV 1200）下觀察氣孔保衛細胞的微管排布的變化（物鏡60×油鏡；480 nm激發光激發）。

1.2.3擬南芥氣孔的觀察將于MS培養基中生長7 d的野生型擬南芥和突變體幼苗分別放入0、1.0、2.5、5.0 μmol/L ABA溶液中浸泡90 min后，取葉片觀察下表皮氣孔的關閉情況。

1.2.4對擬南芥在ABA誘導下根生長的分析MS培養基中生長7 d的野生型擬南芥和突變體幼苗轉移至ABA濃度為0、1.0、2.5、5.0 μmol/L的MS培養基上倒置培養，轉移至光照培養箱中培養，幼苗生長4 d后進行拍照及長度統計。

1.2.5數據統計分析在ABA濃度為0、1.0、2.5、5.0 μmol/L 的MS培養基上倒置培養野生型擬南芥和突變體4 d后，測量彎根后的長度，分析數據得出伸長速率。重復3次，每次重復20組。平均日伸長速率（cm/d）=彎根伸長長度（cm） /彎根時間（d）。

2結果與分析

2.1ABA和微管特異性藥物誘導擬南芥幼苗氣孔關閉的情況

將于MS培養基中生長7 d的野生型擬南芥幼苗分別放入0、1.0、2.5、5.0 μmol/L ABA溶液中浸泡90 min，發現在5 μmol/L ABA 處理下，氣孔關閉更顯著，隨ABA濃度的升高，葉片氣孔關閉越來越顯著（圖1）。為了探究微管骨架是否主動參與到ABA誘導氣孔關閉過程，用氨磺樂靈和ABA處理擬南芥幼苗葉片表皮細胞，發現在ABA和氨磺樂靈共同處理下，氣孔關閉更顯著（圖1-E）。

2.2ABA對氣孔保衛細胞微管骨架的影響

對擬南芥葉片未作處理的情況下，通過激光掃描共聚焦顯微鏡可以清楚地觀察到保衛細胞周質微管長纖維絲由細胞背壁到腹壁輻射排列（圖2-A）。隨后用5 μmol/L ABA處理擬南芥葉片，隨時間增長，越來越多的微管發生解聚（圖2-B至圖2-E），90 min后，可見氣孔關閉，其保衛細胞微管骨架基本解聚，彌散狀熒光隨機充滿整個細胞（圖2-F）。

2.3ABA誘導微管結合蛋白MAP18相關突變體氣孔關閉情況

為了研究MAP18是否參與調控ABA誘導氣孔關閉，分別用5 μmol/L ABA處理野生型擬南芥和突變體的葉片90 min，發現在ABA誘導擬南芥葉片氣孔關閉過程中，野生型葉片氣孔很少完全關閉，75%的OE葉片氣孔完全關閉，R18相對來說現象不顯著（圖3），處于半關閉狀態。2.4ABA誘導擬南芥幼苗的彎根生長

將生長7 d的野生型和突變體幼苗轉移至含不同濃度ABA的MS培養基中進行彎根培養。如圖4-A所示，野生型及突變體在ABA濃度升高后，OE的根伸長明顯減慢，R18在ABA濃度5 μmol/L的MS培養基上根伸長幾乎停止。對根的伸長做數據統計（圖4-B），在未加ABA時OE的根伸長速率為0.60 cm/d，比WT、R18、map18的伸長速率都要高。隨著ABA的濃度升高，OE的伸長速率降低至0.12 cm/d，比WT、map18的伸長速率小。

3討論

3.1ABA誘導的葉片保衛細胞微管骨架的解聚與重組

ABA誘導氣孔關閉作為一個經典體系， 被廣泛關注并應用到很多試驗，并且很多證據表明，在氣孔開關運動中保衛細胞的微管骨架組裝發生了解聚與重組[7-8，15]。ABA與微管在氣孔關閉運動中是否存在聯系尚不清楚。本試驗發現，正常氣孔保衛細胞中微管骨架呈纖維狀從腹壁到背壁輻射狀排列，這與Yu等的研究結果[15]相一致。進一步用外源ABA處

理GFP-α-tubulin-6轉基因擬南芥葉片，激光掃描共聚焦顯微鏡觀察發現ABA處理引起微管骨架的排布發生變化，整齊的輻射狀排列逐步散亂，推測微管排布的動態變化可能參與了ABA誘導氣孔關閉的信號轉導的過程。

3.2MAP18參與ABA誘導的葉片保衛細胞微管骨架降解、根伸長減慢的過程

微管是植物細胞的骨架，在植物生理方面有許多重要作用，周質微管排列的變化顯著影響細胞形態及生長方向，在快速伸長的細胞中，周質微管以橫向排列為主，而在伸長比較緩慢或停止伸長的細胞中，周質微管以斜向或縱向排列為主[16-18]。當用ABA處理擬南芥幼苗初生根時，根生長減緩，其微管骨架也會隨之發生變化，且微管結合蛋白MAP18過表達植株OE的生長速率降低顯著，WT和突變株map18沒有OE敏感，由此推測，MAP18在ABA抑制根伸長中起著一定的促進作用。在ABA誘導氣孔關閉的試驗中，OE更敏感，MAP18 RNAi沉默株R18相對來說不敏感，推測ABA在誘導氣孔關閉中，MAP18促進ABA降解氣孔保衛細胞微管骨架。

本研究深入探討了ABA在誘導氣孔關閉中的作用和可能的作用機制，為微管骨架參與氣孔運動提供了又一新思路；但是在ABA誘導氣孔關閉和抑制根生長過程中，MAP18如何與ABA相互作用的機制等一系列問題尚需進一步研究。

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