紅顏草莓的離體培養(yǎng)與快速繁殖

摘要：以紅顏草莓的莖尖作為外植體，研究了外植體的消毒方法、激素組合對(duì)其離體培養(yǎng)與快速繁殖的影響。結(jié)果表明，幼莖段在0.1%氯化汞+3滴吐溫-80溶液中浸泡5 min滅菌效果最好；莖尖以0.35 mm大小為宜；誘導(dǎo)叢生芽的最適培養(yǎng)基為：MS+0.5 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA；誘導(dǎo)試管苗生根的最適培養(yǎng)基為：1/2MS+0.1 mg/L IBA。

關(guān)鍵詞：草莓；離體培養(yǎng)；不定芽；快速繁殖

中圖分類號(hào)： S668.404+.3文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號(hào)：1002-1302（2015）11-0066-03

收稿日期：2015-04-14

基金項(xiàng)目：2014年江蘇省農(nóng)業(yè)三新工程（編號(hào)：SXGC[2014]141）。

作者簡(jiǎn)介：李慧（1971—），女，江蘇宿遷人，碩士，教授，主要從事園藝作物的組織培養(yǎng)研究。E-mail：lihui710623@163.com。紅顏又稱日本99、紅頰，是日本靜岡縣用章姬與幸香雜交育成的早熟草莓栽培品種。葉片大、新莖分枝多，結(jié)果能力強(qiáng)，果實(shí)品質(zhì)好，果粒個(gè)大，果形、果色、價(jià)格明顯優(yōu)于豐香草莓。是春節(jié)前后集采摘、鮮食為一體的休閑旅游消費(fèi)農(nóng)產(chǎn)品，深受廣大果農(nóng)和顧客的喜愛。但是，紅顏草莓苗不抗白粉病，不易育苗，幼苗一旦染病，幾天內(nèi)將全軍覆沒。因此，試管苗的繁育將有很大的市場(chǎng)前景。

1材料與方法

1.1材料

試驗(yàn)于2014年12月至2015年4月進(jìn)行。供試材料紅顏草莓苗引自淮安怡園果蔬種植專業(yè)合作社（實(shí)生苗2014年9月栽植在江蘇聯(lián)合職業(yè)技術(shù)學(xué)院淮安生物工程分院花卉實(shí)訓(xùn)中心的無土栽培槽內(nèi)）。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1表面滅菌試驗(yàn)于晴天的下午取供試紅顏草莓剛抽出的匍匐莖的幼莖段（母株要健壯、無病），流水沖洗泥土、灰塵。在無菌條件下，先用75%乙醇浸泡20～30 s，無菌水沖洗3～4次，再轉(zhuǎn)入0.1%氯化汞溶液+2滴吐溫-80分別浸泡8、5、4、2 min，無菌水沖洗5～8次。在以上的過程中要不斷搖動(dòng)，以去除附在外植體表面的氣泡。用消毒濾紙吸干水珠后，將莖尖接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，調(diào)整pH值至5.6～5.8。每個(gè)滅菌處理各接種50瓶，1個(gè)外植體/瓶，20 d后觀察記錄外植體的污染、死亡、無菌成活生長(zhǎng)等情況。

1.2.2莖尖分化能力試驗(yàn)取“1.2.1”節(jié)試驗(yàn)最佳處理，在雙目顯微解剖鏡下剝?nèi)グ陀兹~，將莖尖接種于MS+0.5 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA培養(yǎng)基中[1]。接種外植體1個(gè)/瓶，30 d后觀察記錄莖尖分化情況。

1.2.3芽誘導(dǎo)試驗(yàn)取“1.2.2”節(jié)試驗(yàn)中最佳的莖尖剝制處理分別接種于以0.5 mg/L 6-BA為基礎(chǔ)的附加不同種類生長(zhǎng)素（0.2 mg/L）配成的培養(yǎng)基、以0.2 mg/L NAA為基礎(chǔ)的附加不同種類生長(zhǎng)素及細(xì)胞分裂素（0.5 mg/L）配成的培養(yǎng)基中[2]，每個(gè)處理各接種30瓶，1個(gè)外植體/瓶，30 d后開始調(diào)查記錄幼芽分化情況。

1.2.4繼代培養(yǎng)與擴(kuò)大繁殖將長(zhǎng)至1～2 cm的叢生芽每4～6株切成1塊，轉(zhuǎn)入不同濃度配比的6-BA和NAA配成的繼代培養(yǎng)基中。每種處理接種20瓶，4塊/瓶，培養(yǎng)20 d后統(tǒng)計(jì)每瓶幼苗數(shù)量，并計(jì)算出增殖率。

1.2.5根誘導(dǎo)試驗(yàn)用1/2MS附加不同濃度（mg/L）IBA，有0.05、0.10、0.20、0.50 mg/L及不加IBA的5個(gè)處理，接入幼苗3周后觀察記錄根的生長(zhǎng)情況。

培養(yǎng)基均加3%蔗糖，在1.0～1.1大氣壓下熱壓滅菌20 min。培養(yǎng)溫度（25±2） ℃。每日光照12 h，光照度2 000 lx 。

2結(jié)果與分析

2.1不同消毒劑對(duì)紅顏幼莖滅菌的效果

在草莓組織培養(yǎng)中常用滅菌劑的種類很多。我們?cè)眠^次氯酸鈉10%水溶液（含有效氯0.4%～0.5%），浸泡接種材料10～15 min；次氯酸鈣（漂白粉），用其飽和上清液，浸泡接種材料15～30 min；過氧化氫10%～12%水溶液，浸泡10～20 min ；新潔爾滅5%～10%水溶液，浸泡10～15 min；氯化汞0.1%水溶液，浸泡8～10 min。其中，前4種滅菌劑對(duì)接種材料比較安全，不會(huì)使活組織中毒死亡，但因滅菌時(shí)間較長(zhǎng)，常常使接種材料的外層氧化變褐，影響培養(yǎng)效果。氯化汞有很強(qiáng)的殺菌能力，但浸泡時(shí)間稍長(zhǎng)會(huì)造成接種材料中毒。即使在氯化汞處理完后，用無菌水沖洗7～8次，仍然有少量殘留在外植體上，導(dǎo)致外植體死亡。

用0.1%氯化汞溶液浸泡處理5 min，外植體染菌率為0，成活率為78%；4 min浸泡莖段，外植體總?cè)揪蕿?8%，死亡7個(gè)；當(dāng)莖段浸泡2 min后，外植體死亡數(shù)為3個(gè)，但總?cè)揪矢哌_(dá)56%（表1）。

觀察中發(fā)現(xiàn)4種處理外植體在接種1周內(nèi)都有不同程度褐化現(xiàn)象并導(dǎo)致生長(zhǎng)緩慢，10 d后成活的外植體褐化現(xiàn)象消失（圖1、圖2）。這可能是因?yàn)槭褂靡掖歼M(jìn)行表面消毒時(shí)，乙醇毒害所致。

2.2不同大小的莖尖對(duì)形態(tài)發(fā)生能力的影響

剝制后的紅顏莖尖接種在芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，7 d后開始膨大，并在外植體表面產(chǎn)生愈傷組織，20 d后部分愈傷組織上可形成幼芽。從表2可以看出，小于或等于0.1 mm的莖尖，無形態(tài)發(fā)生能力；當(dāng)莖尖達(dá)0.2 mm時(shí)，只有有限的生長(zhǎng)；莖尖大小達(dá)0.35 mm，帶有最后1對(duì)較大的葉原基，而沒有頂端下組織時(shí)，莖尖的分化率最高；如果切取0.5 mm的莖尖，發(fā)現(xiàn)莖尖直接形成單株苗，形成愈傷組織的百分率顯著下降。

2.4不同濃度6-BA和NAA對(duì)幼苗增殖的影響

增殖培養(yǎng)基的篩選中，附加6-BA 0.5 mg/L分化反應(yīng)正常，雖然在相同的時(shí)間里新芽分化量相對(duì)較少，而長(zhǎng)成正常幼苗的數(shù)量卻明顯較多。當(dāng)6-BA濃度超過1.0 mg/L時(shí)，新芽分化量很大，也都能長(zhǎng)出葉片，只是葉片簇生在一起成球狀，不能長(zhǎng)成正常幼苗（表5）。從表5可以看出，2號(hào)培養(yǎng)基對(duì)幼苗增殖的生長(zhǎng)分化最為有利。

此外，轉(zhuǎn)苗過程中去掉原生葉片有利于新苗分化，在擴(kuò)大繁殖中剔除愈傷組織，有利于新苗增殖和生長(zhǎng)。

2.5不同濃度IBA對(duì)試管苗生根的影響

從表6可以看出，以IBA 0.1 mg/L濃度處理的生根率最高，為100%，平均根條數(shù)為2.3條。不加IBA及IBA超過02 mg/L，多數(shù)苗都是先于苗基切口處產(chǎn)生愈傷組織，隨后在愈傷組織上分化生根。當(dāng)生根苗移出栽植后，苗基的愈傷組織很快干死，使苗與根間形成了1個(gè)隔離層，成活率大大降低。

3討論

本試驗(yàn)以紅顏草莓為供試材料，研究其莖尖經(jīng)脫分化后多數(shù)為愈傷組織上生根 0.50愈傷組織上生根 注：不同處理參試苗為150個(gè)，培養(yǎng)3周后統(tǒng)計(jì)結(jié)果。

誘導(dǎo)不定芽發(fā)生的因子，旨在提高草莓不定芽發(fā)生率。在植物離體形態(tài)發(fā)生中，影響器官分化的因素很多，但以植物激素的調(diào)控為主[3-6]。不同植物種類，控制其不定芽發(fā)生的植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的種類、濃度以及它們之間的組合不同，本試驗(yàn)中為BA與NAA的不同濃度組合。從不定芽發(fā)生的動(dòng)態(tài)觀察中可知，不定芽發(fā)生高峰期集中在接種后20～40 d的時(shí)間段內(nèi)，50 d以后再生的不定芽，其芽體弱小，生長(zhǎng)速度慢。這可能是由于隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)消耗大；同時(shí)，外植體自身分泌物的積累限制了不定芽的分化及生長(zhǎng)，也可能與愈傷組織內(nèi)某些生理生化物質(zhì)的積累有關(guān)。

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