PCR方法檢測大腸桿菌iss基因的缺陷及改進

樊琛　徐旺燁　李丹丹等

摘要：采用KOD酶和rTaq酶，分別通過套式PCR檢測10株大腸桿菌iss基因，以探討PCR檢測大腸桿菌iss基因的缺陷及改進方法。結(jié)果表明，rTaq酶、KOD酶對大腸桿菌iss基因1次PCR檢出率分別為40%、70%，套式PCR檢出率分別為80%、100%；KOD酶1次PCR檢出率高于rTaq酶，但未達100%，采用KOD酶套式PCR可降低大腸桿菌iss基因的漏檢可能性。

關(guān)鍵詞：PCR檢測；iss基因；套式；檢出率；大腸桿菌

中圖分類號： S852.61+2文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2015）11-0069-02

收稿日期：2014-11-07

基金項目：國家自然科學青年基金（編號：31302128）。

作者簡介：樊琛（1978—），女，山東聊城人，博士，副教授，主要從事病原體分子生物學、食品安全研究。E-mail：fanchen7810@126.com。iss基因（increased serum survival gene）是編碼大腸桿菌補體抗性的基因，大小為309 bp，在人源、禽源大腸桿菌中皆有發(fā)現(xiàn)。1979年，Binns等從人源大腸桿菌ColV、I-K94質(zhì)粒獲得iss基因表達，能顯著增強含此基因大腸桿菌對1日齡雛雞的毒力，還能增強轉(zhuǎn)化菌的血清抗性[1-2]。目前，國外相關(guān)研究者大多將iss基因檢測作為大腸桿菌毒力檢測的參考指標之一，以1次PCR檢測結(jié)果iss+或iss-來判定iss基因在大腸桿菌中的存在情況。大腸桿菌iss基因通常采用PCR方法或DNA探針方法檢測，這2種方法檢測結(jié)果可能出現(xiàn)不符合性，即某菌株P(guān)CR檢測可能為iss+而探針檢測為iss-，或PCR檢測為iss-而探針檢測為iss+[3-5]。而在實際應用中，多以PCR檢測結(jié)果判定iss在大腸桿菌中的存在情況。本試驗探討PCR方法檢測大腸桿菌iss基因缺陷的原因和改進方法，以提高PCR檢測大腸桿菌iss基因的準確性。1材料與方法

1.1菌株及其來源

10株大腸桿菌，分別采自黑龍江省、山東省、貴州省、新疆維吾爾自治區(qū)、北京市等地的雞場。

1.2引物合成

1.3酶類及主要生化試劑

蛋白酶K、RnaseA、rTaq酶、KOD酶、T4DNA連接酶、pMD19-T vector克隆載體及相關(guān)試劑，均購自寶泰克生物工程公司；DNA膠回收試劑盒，購自上海華舜生物工程有限公司；所用試驗試劑均為分析純。

1.4大腸桿菌DNA提取

將待測菌瓊脂板劃線分離，挑取平板上菌落直徑2 mm的單菌落；加入40 μL裂解液（10 mmol/L Tris-Cl、pH值為7.5，1 mmol/L EDTA）和50μg/mL蛋白酶K，混勻；55 ℃溫育10 min，再于80 ℃溫育10 min，加80 μL滅菌三蒸水，-20 ℃保存。

1.5iss基因檢測擴增反應體系

iss PCR擴增反應體系為：10×PCR buffer 5 μL、dNTP 4 μL、50 pmol/μL上游和下游引物各1 μL、大腸桿菌DNA模板5 μL、滅菌三蒸水33.5 μL，rTaq酶0.5 μL，共50 μL。套式PCR擴增反應體系為：10×PCR buffer 5 μL、dNTP 4 μL、50 pmol/μL 上游和下游引物各1 μL、大腸桿菌DNA模板 2 μL、滅菌三蒸水33.5 μL、rTaq酶0.5 μL，共50 μL。

1.6擴增反應程序

1.6.1rTaq酶PCR擴增反應程序97 ℃預變性5 min；97 ℃ 1 min、47 ℃ 1 min、72 ℃ 30 s，9個循環(huán)；95 ℃ 1 min、48 ℃ 1 min、72 ℃ 30 s，25個循環(huán)；72 ℃ 10 min；4 ℃ 保存。重復2次。對PCR擴增反應未得到目的片段的菌株進行套式PCR擴增反應，反應程序為：95 ℃預變性5 min；95 ℃ 30 s、57.5 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s，28個循環(huán)；72 ℃ 10 min；4 ℃ 保存。經(jīng)連接轉(zhuǎn)化，送生工生物工程（上海）股份有限公司進行測序。

1.6.2KOD酶PCR擴增反應程序97 ℃預變性5 min；97 ℃ 1 min、47 ℃ 1 min、68 ℃ 30 s，9個循環(huán)；95 ℃ 1 min、68 ℃ 1 min、72 ℃ 30 s，25個循環(huán)；72 ℃ 10 min；4 ℃ 保存。重復1次。對PCR擴增反應未得到目的片段的菌株進行套式PCR擴增反應，反應程序為：95 ℃預變性5 min；95 ℃ 30 s、57.5 ℃ 30 s、68 ℃ 30 s，28個循環(huán)；72 ℃ 10 min；4 ℃ 保存。同時做空白對照。經(jīng)連接轉(zhuǎn)化，送生工生物工程（上海）股份有限公司進行測序。

2結(jié)果與分析

由表1可見，10株大腸桿菌都含有iss基因；rTaq酶1次PCR檢測4株菌株為陽性，6株為陰性，檢測率為40%；套式PCR檢測出現(xiàn)特異條帶，2株菌株檢測為陰性，擴增出的iss基因經(jīng)序列測定，其核苷酸序列符合已發(fā)表的iss基因核苷酸序列，rTaq酶套式PCR檢出率為80%；KOD酶1次PCR檢測7株菌株為陽性，3株為陰性，檢出率為70%，但重復性上有差異，陰性、陽性菌株有所不同，套式PCR檢測也出現(xiàn)特異條帶，10株大腸桿菌都含有iss基因，檢出率為100%，擴增出的iss基因經(jīng)序列測定，其核苷酸序列與已發(fā)表的iss基因核苷酸序列也相符。

3結(jié)論與討論

研究發(fā)現(xiàn)，iss基因在致病性大腸桿菌中的存在率要高于非致病性大腸桿菌。Johnson等對20株禽大腸桿菌進行iss基因擴增及致病性試驗，結(jié)果表明，6株致病性菌株為iss基因擴增陽性，14株非致病性菌株中有11株未擴增出iss基因、3株擴增出iss基因[7]。關(guān)于iss基因的定位，近來普遍認為iss基因是定位在ColV質(zhì)粒上。有研究表明，在產(chǎn)生大腸菌素V（colicin V）的菌株中，人血液中有95.5%的菌株攜帶iss基因，腸道中有68.8%的菌株攜帶iss基因；禽源大腸桿菌iss基因與ColV同時出現(xiàn)的概率很高，iss基因很可能與ColV質(zhì)粒連在一起[8-9]。大腸桿菌ColV質(zhì)粒是低拷貝的大質(zhì)粒[10-11]。本試驗PCR所用模板為菌體經(jīng)蛋白酶K消化后的粗提物，菌體消化程度可能影響PCR擴增效率，采用常規(guī)質(zhì)粒提取及大質(zhì)粒提取方法均未獲得ColV質(zhì)粒。另外，由于ColV質(zhì)粒在各菌株中的拷貝數(shù)可能有所差異，也會導致ColV質(zhì)粒極低拷貝的菌株在1次PCR時未能擴增出目的條帶。

試驗結(jié)果表明，rTaq酶與KOD酶1次PCR時，iss基因的檢出率分別為40%、70%，套式PCR檢出率分別為80%、100%，KOD酶檢測大腸桿菌iss基因的檢出率均高于rTaq酶，KOD酶對大腸桿菌iss基因擴增效率優(yōu)于rTaq酶。在重復性方面，KOD酶1次PCR檢測10株菌株中有2株菌株出現(xiàn)差異，可能與模板制備中菌體消化裂解程度及操作誤差有關(guān)；KOD酶套式PCR結(jié)果無差異，采用KOD酶套式PCR檢測能降低大腸桿菌iss基因的漏檢率。

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