冀中南地區16個平菇栽培菌株的ISSR分析

鄭素月　鄭偉　邢志偉等

摘要：應用ISSR分子標記技術對16個平菇栽培菌株進行遺傳多樣性研究。從16個ISSR引物中篩選出8個引物，擴增到78個多態性位點，其大小分布在200～3 000 bp之間。聚類分析結果表明，16個平菇菌株在遺傳相似系數為0.75處可分為6個組群：第1組包括為以89為代表的5個菌株；第2組包括白平菇菌株；第3組包括以冀農11為代表的4個菌株；第4組包括558菌株；第5組包括以99為代表的3個菌株；第6組包括以夏抗8為代表的2個高溫菌株。

關鍵詞：平菇；ISSR；遺傳多樣性；聚類分析

中圖分類號： S646.1+40.4文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2015）11-0073-03

收稿日期：2015-04-07

基金項目：河北省現代農業產業技術體系食用菌產業創新團隊建設專項；河北省科技支撐計劃 （編號：15226404D）。

作者簡介：鄭素月（1969—），女，河北石家莊人，博士，教授，主要從事食用菌新品種選育與菌種生產技術方面的研究。E-mail：zhengsuyue@sina.com。平菇營養豐富，味道鮮美，具有較高的營養價值和保健功能，是人們喜愛的食用菌之一。平菇抗逆性強、適應性好、產量高、易栽培，是我國栽培規模最大、產量最高的一種食用菌。目前，生產上平菇菌種混雜、種源不清、同物異名嚴重，嚴重制約平菇產業的發展。隨著科學技術的迅猛發展，許多生化和分子生物學手段已在食用菌種質資源研究中得到了廣泛應用。微衛星間區分子標記技術具有多態性豐富、穩定可靠、試驗重復性好等優點，在食用菌種質鑒定方面得到了廣泛的應用。張金霞等利用ISSR技術對側耳屬菌株進行研究[1-2]；李輝平等利用ISSR技術研究木耳菌株的遺傳多樣性[3-4]；李瑩等研究杏鮑菇的ISSR標記多態性[5]；秦蓮花等用ISSR鑒別香菇生產用種[6-7]。本試驗采用ISSR分子標記技術，對河北省冀中南地區16個平菇生產菌株進行鑒別及遺傳多樣性分析，可為解決平菇品種混亂、對平菇進行資源利用和品種選育奠定基礎。

1材料與方法

1.1供試菌株及來源

供試平菇菌株共16個，分別收集于河北省冀中南地區，由筆者所在實驗室保存。菌株編號、名稱見表1。

1.2方法

1.2.1DNA提取PDA培養基平板上鋪玻璃紙隔膜培養菌表1供試菌株絲，液氮研磨菌絲后用DNA提取試劑盒提取菌株DNA， 0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA質量，紫外分光光度計測定其D260 nm、D280 nm ，去離子水稀釋到20 ng/μL左右， -20 ℃保存備用。

1.2.2引物篩選所用引物及擴增程序參考李輝平的研究[8]，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，引物序列見表2。

1.2.3PCR反應體系25 μL反應體系：2 μL DNA模板（約50 ng），2.5 μL 10×Taq PCR buffer，0.8 μL dNTPs（各0.25 mmol/L） ，1 μL引物（10 μmol/L），0.2 μL Taq DNA聚合酶（5 U/μL），18.5 μL雙蒸水。

1.2.4擴增程序94 ℃預變性4 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火40 s，72 ℃延伸2 min，共35個循環；72 ℃補齊10 min； 4 ℃終止反應。

1.2.5瓊脂糖凝膠電泳配制1.4%瓊脂糖凝膠，緩沖液為1×TAE，PCR產物在電壓100 V下電泳70 min。

2結果與分析

2.1DNA提取結果

16個菌株基因組DNA提取結果見圖1。由于采用了基因組DNA提取試劑盒，與傳統的DNA提取方法相比，得到的DNA比較純凈，條帶清晰、雜質較少，在紫外分光光度計上測定其D260 nm、D280 nm。可以看出，D260 nm、D280 nm 值均在1.8～2.0

之間，可用于PCR擴增。

2.2引物的篩選

本試驗從供試的16個ISSR引物中篩選出8個擴增效果較好的引物，可擴增出所有供試菌株的DNA條帶，且條帶清晰、穩定、分布合理、重復性好，而在對照中沒有擴增出DNA條帶。這些引物分別為P2、P3、P5、P6、P7、P8、P11、P13。

2.3ISSR擴增圖譜分析

用篩選出的8個引物對16個平菇菌株進行ISSR擴增，共擴增出78個多態性位點（圖2），且分布均勻，大小在200～3 000 bp之間。以凝膠DNA片段的有無分別記為1或0，用統計軟件NTSYSpc計算菌株間的遺傳相似性系數，進行遺傳相似性分析。由圖3聚類分析結果可知，遺傳相似水平在0.75 左右，16個菌株分為6個組群：第1組（Ⅰ）包括為以89為代表的5個菌株；第2組（Ⅱ）包括白平菇菌株；第3組（Ⅲ）包括以冀農11為代表的4個菌株；第4組（Ⅳ）包括558菌株；第5組（Ⅴ）包括以99為代表3個菌株；第6組（Ⅵ）包括夏抗8為代表的2個高溫菌株。

3結論與討論

ISSR分子標記技術是1994年由Zietkiewicz等創建的一種簡單序列重復區間擴增多態性分子標記，其技術原理是在SSR序列的3′端或5′端加錨1～4個隨機的堿基為引物，對兩側具有反向排列的簡單序列間的基因片段進行擴增，不僅多態性好、穩定性高，而且簡單、快速、通用性好，在食用菌種質資源研究中得到了廣泛的應用[9]。筆者所在課題組在前期工作中收集了冀中南地區54個不同栽培平菇菌株，并進行了拮抗與酯酶同工酶測定，將54個菌株分為12個營養不親和群[10]。本試驗在此基礎上選取16個代表菌株進一步進行ISSR分析。結果表明，用篩選出的8個引物對平菇菌株DNA進行ISSR擴增，共擴增出78個多態性位點，大小在200～3 000 bp 之間，且分布均勻。聚類分析結果表明，同一營養親和群的平菇89和早秋615、雙抗黑平和新平106、以及99、特抗黑平和平菇206菌株群內ISSR圖譜完全相同，不同營養親和群菌株ISSR圖譜存在差異，進一步說明ISSR分析在食用菌菌株鑒定方面的可靠性。

參考文獻：

[1]張金霞，黃晨陽，管桂萍，等. 白黃側耳Pleurotus cornucopiae微衛星間區（ISSR）分析[J]. 菌物學報，2007，26（1）：115-121.

[2]馬志剛，呂作舟，鄭和斌，等. ISSR標記在側耳屬菌株分類學中的初步應用[J]. 華中農業大學學報，2006，25（1）：55-59.

[3]李輝平，黃晨陽，陳強，等. 黑木耳栽培菌株的ISSR分析[J]. 園藝學報，2007，34（4）：935-940.

[4]戴肖東，馬銀鵬，張介馳，等. 黑龍江省木耳主栽品種遺傳多樣性分析[J]. 生物技術，2014，24（5）：86-89.

[5]李瑩，李莉，劉艷玲，等. 杏鮑菇菌種遺傳多態性的ISSR分析[J]. 微生物學雜志，2014，34（2）：24-28.

[6]秦蓮花，宋春艷，譚琦，等. 用ITS和ISSR分子標記技術鑒別香菇生產用種[J]. 菌物學報，2006，25（1）：94-100.

[7]賈定洪，王波，鄭林用，等. 應用拮抗及ISSR方法鑒定袋料香菇菌株[J]. 西南農業學報，2013，26（2）：832-834.

[8]李輝平. 應用ISSR標記對食用菌的遺傳多樣性分析[D]. 北京：中國農業科學院，2007.

[9]Zietkiewicz E，Rafalski A，Labuda D. Genome fingerprinting by simple sequence repeat（SSR）-anchored polymerase chain reaction amplification[J]. Genomics，1994，20（2）：176-183.

[10]鄭素月，張慶橋.生化標記在河北省栽培平菇種質資源鑒別中的應用研究[J]. 北方園藝，2011（14）：162-164.謝菲，陳茹陽，趙惠恩. 蒙菊（Chrysanthemum mongolicum）再生體系的建立[J]. 江蘇農業科學，2015，43（11：76-78.