西藏砂生槐EST—SSR引物開發及多態性檢測

符亞茹，李少珂，姚衛杰，等(78)

摘要：砂生槐為青藏高原特有灌木種，具有重要生態價值。開發多態EST-SSR 引物對其居群遺傳多樣性研究及保護策略的制定具有重要意義。利用SciRoKo v3.4軟件對前期獲得的砂生槐轉錄組中146 943個轉錄本進行掃描共發現9 428個SSR位點。轉錄本中的微衛星種類十分豐富，其中以三核苷酸和五核苷酸重復最多，分別占SSR總位點數的33.32%和21.70%，重復次數主要集中在3～9次重復。其中（AG/CT）n、（GA/TC）n、（GAA/TTC）n、（AAAAT/ATTTT）n 重復基序最多，占總重復基序的4.50%、 4.34%、 3.13%和2.44%。本研究中設計130對EST-SSR引物，有80對擴增出預期大小條帶，經變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測，最終有11對具有較高多態性，且對于30個模板得到的位點平均等位基因數為2.9；觀測雜合度（HO）和期望雜合度（HE）平均值分別為0.423 9和0.336 4。

關鍵詞：砂生槐；轉錄本；EST-SSR；多態性；引物

中圖分類號： S718.43文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2015）11-0078-04

收稿日期：2014-12-19

基金項目：國家自然科學基金（編號：31260189）；西藏特色農牧資源研發協同創新中心建設——高原生態。

作者簡介：符亞茹（1988—），女，陜西西安人，碩士研究生，主要從事高原植物分子生態研究。E-mail： fuyaruxw@126. com。

通信作者：李慧娥，博士，副教授，主要從事高原植物分子生物學研究。E-mail： lihuiesh@126.com。砂生槐[Sophora moorcroftiana （Benth.） Benth. ex Baker]為青藏高原特有豆科槐屬矮灌木。主要分布在青藏高原海拔2 800～4 400 m的西藏“一江兩河（雅魯藏布江、拉薩河、年楚河）”河谷寬谷段的沙質地上，在雅魯藏布江寬河谷形成大片群落[1]。該樹種為青藏高原干旱河谷半固定沙地上的先鋒灌叢植物[2]。由于其極強的抗旱、防風固沙特點，目前已成為青藏高原人工造林先鋒樹種，具有重要的生態價值。但由于砂生槐分布區的過度放牧及薪炭過度樵采等人為干擾，導致青藏高原獨有的砂生槐種群嚴重退化，甚至一些種群正逐步消失，為此對砂生槐的保護迫在眉睫。

基于遺傳學與分子生物學的植物遺傳多樣性研究為資源保護提供了新的理論指導。分子標記是遺傳多樣性研究的重要手段之一，常用DNA分子標記中簡單重復序列（simple sequence repeats， SSR）[3]又稱微衛星（microsatellite）[4]，因其具有共顯性分離、重復性強、DNA樣本用量少、位點專一且多態性高等優點[5]，已廣泛運用于植物遺傳多樣性分析中[6-9]。本實驗室前期已經獲取了砂生槐的轉錄組數據（GenBank 登錄號： SRP041237）[10]，這為成功開發砂生槐多態EST-SSR引物提供了前提，本研究則基于此轉錄組數據開發用于分析砂生槐遺傳多樣性的多態EST-SSR引物。

1材料與方法

1.1試驗材料

來自于青藏高原不同分布區的共30個砂生槐單株用于多態SSR引物開發。

1.2總DNA提取和檢測

取砂生槐葉片0.3 g，采用改良無液氮CTAB法[11]提取總DNA。瓊脂糖凝膠和微量紫外分光光度計（NanoDrop 2000 C，美國）對其濃度和純度進行精確檢測，-20 ℃保存備用。

1.3SSR引物來源及引物設計

用高通量Illumina 2代測序技術對砂生槐RNA樣本進行測序，得到clean data 數據。再利用CLC Genomics Workbench v6.5（CLC Bio， Denmark）軟件對高通量數據進行拼接分析，最后用SciRoKo 3.4[12]軟件對轉錄組所有轉錄本進行SSR位點掃描。從中選取三重復基元最終設計并合成130對SSR引物用于多態引物篩選。

利用Primer Premier 6.0軟件，對含有SSR位點的EST序列進行引物設計，設定標準為：GC含量40%～60%，退火溫度55～60 ℃，引物長度范圍17～25 bp，擴展片段長度110～200 bp。

1.4PCR擴增及電泳檢測

PCR擴增體系為20 μL：上下游引物各1 μL，DNA模板3 μL （10 ng/μL），PCR擴增Mix （康為世紀生物科技有限公司，北京）10 μL，超純水5 μL。PCR擴增條件為：94 ℃預變性4 min；95 ℃變性30 s，退火30 s，72 ℃延伸40 s，35個循環；72 ℃延伸5 min。

用濃度為2%的瓊脂糖凝膠對PCR產物進行檢查，查看是否有預期大小擴增產物。然后對能擴增出條帶的產物進行8%變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測[13]，以10 bp DNA maker （廣州東盛）作為分子量標準，電泳后銀染[14]染色，在凝膠成像系統（GBOX-F3-E，英國）對條帶進行掃描分析，并照相保存。

1.5數據處理和分析

根據擴增產物條帶的遷移率，對照分子量標準分別統計每個位點等位基因片段長度，獲得數據矩陣。用軟件PowerMarker v3.0[15]對每個位點等位基因數（NA）、觀測雜合度（HO）和期望雜合度（HE）、連鎖平衡（LD）和哈溫平衡（HWE）進行檢測及評價。

2結果與分析

2.1砂生槐轉錄組SSR位點掃描

用SciRoKo 3.4軟件默認參數對146 943個砂生槐轉錄本進行掃描共發現9 428個SSR 位點，其SSR 數量、類型及頻率見表1，SSR中主要重復基元的類型及頻率見表2。由表1、表2可知，SSR種類豐富，且不同類型SSR出現頻率不同，除單核苷酸外，其他核苷酸重復所占總SSR比例從12.61%到33.32%；以三、五核苷酸重復為主，分別占SSR總數的33.32%和21.70%；其他類型所占比例相對較小，其中四核苷酸最少；重復次數主要集中在3～9次重復。從不同 SSR 基元出現頻率來看（表2），二核苷酸中以（AG/CT）n和（GA/TC）n為主，所占其重復基元的比例分別為33.41%和32.23%；三核苷酸種類豐富，其中以（GAA/TTC）n、（AAG/CTT）n和（AGA/TCT）n最多，分別占其重復基元的11.94%、7.61%、7.49%，其他較少；四核苷酸中以（AAAT/ATTT）n最多，占13.05%；另外五、六核苷酸分別以（AAAAT/ATTTT）n和（AAAAAT/ATTTTT）n最多；占總重復基元的主要重復基元類型是AG/CT （4.50%）、GA/TC（4.34%）、GAA/TTC （3.13%）和AAAAT/ATTTT（2.44%）。基于此掃描結果根據SSR位點側翼序列共設計并合成130對引物供篩選。

2.2擴增產物長度差異的SSR引物

首先用130對引物對2個來自不同分布區的砂生槐DNA模板進行PCR預擴增，2%瓊脂糖凝膠電泳結果顯示其中80對引物擴增出預期大小條帶（圖1）。用此80對引物對30個不同分布區的模板進行擴增的PCR產物經8%變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測（圖2），最終有41對引物對不同模板的擴增顯示出差異，其中有19對差異變化較大，其引物信息見表3。

2.3多態SSR引物篩選

用PowerMarker 3.0軟件對表3中19個SSR位點進行分析，結果表明，其中8個SSR位點分析結果偏離哈溫平衡達極顯著水平。因此，最終篩選11個多態SSR位點，其等位基因數（NA）、觀測雜合度（HO）和期望雜合度（HE）、連鎖平衡及哈溫平衡分析結果見表4。

3討論與結論

對于缺乏基因組信息的物種來說，欲開發應用于遺傳多樣性的多態SSR引物成本高、耗時長。基于高通量轉錄組數據開發多態EST-SSR引物具有開發成本低、操作簡便、信息量大等優勢而被廣泛應用[17]。砂生槐因其分布范圍狹窄、分布地交通不便等原因一直沒有相關基因組序列被公開報道，本研究基于實驗室前期獲得的轉錄組數據，設計的SSR引物表3砂生槐擴增產物長度差異的EST-SSR引物中 61.5%能在基因組DNA上擴增出預期大小條帶，未成功擴增的引物可能是由于：2條引物被內含子隔開；引物位置恰好位于內含子或外顯子剪切點；EST片段發生了變化等而導致無法有效擴增。

砂生槐高通量轉錄組中微衛星的種類非常豐富，從單核苷酸到六核苷酸都具有豐富的類型，其中以三核苷酸和五核苷酸重復為主，分別占SSR總數的33.32%和21.70%，目前在大多數物種如豌豆[18]、蘋果[19]、紅豆杉[20]、杜仲[21]等中，研究發現二核苷酸和三核苷酸是最常見的轉錄組SSR重復基序類型。主要重復基元的比較分析表明，二核苷酸中的

表411對砂生槐多態EST-SSR位點信息

位點NAHOHEP（Seq-Bon）Sm2430.509 40.700 00.039 0（0.007 3）Sm5030.235 00.266 71.000 0（0.050 0）Sm6920.444 40.400 00.702 0（0.025 3）Sm7730.539 40.500 00.144 0（0.012 7）Sm8220.497 80.266 70.007 0（0.006 4）Sm8550.570 60.233 30.000 0（0.004 6）Sm9540.501 70.366 70.002 0（0.005 1）Sm10120.432 80.300 00.097 0（0.010 2）Sm11230.399 40.266 70.087 0（0.008 5）Sm12230.212 80.133 30.004 0（0.005 7）Sm12720.320 00.266 70.303 0（0.017 0）Mean2.90.423 90.336 4 注：本表中所篩選的11個SSR位點為表3中加粗位點。

AG/CT重復，三核苷酸中的GAA/TTC重復，四核苷酸中的AAAT/ATTT重復和五核苷酸中的AAAAT/ATTTT重復在各類重復基元中所占比例最大，六核苷酸各重復類型所占的比例都較低，這與桑樹[23]較為相似。EST-SSR發生頻率和密度、重復基元類型在不同物種間存在較大差異，這可能與物種基因組組成、轉錄組測序方法、數據量大小、微衛星搜索標準等不同有較大的關系。物種三核苷酸基序數量較多可能是對自然選擇機制的一種積極響應，這對物種的生存競爭具有重要意義，且三核苷酸基序的SSR位點具有轉高的遺傳變異[22]，因此本研究主要選取三核苷酸基序的SSR位點設計引物進行分析。

對不同植物種類SSR位點分析結果顯示，每個SSR位點的平均等位基因數約為10.0，期望雜合度約為0.61[24]，本研究中，80對砂生槐EST-SSR嚴格控制分析結果后，最終有11對引物顯示出較高的多態性。在這11個位點中盡管Sm24和Sm77位點的遺傳多樣性相對于其他位點來說較高，但多數位點平均等位基因數和期望雜合度都低于上述平均值，這可能是因為文獻所列這2項指標的平均值僅基于部分物種所得引起的偏差及砂生槐分布范圍狹窄所致。

綜上，利用砂生槐轉錄組數據開發多態EST-SSR引物是可行的，同時最終篩選出的這11對多態EST-SSR引物可以用于后期砂生槐天然居群遺傳多樣性分析、核心種質庫構建、分子標記輔助育種、功能基因挖掘等研究中。

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