4株石杉堿甲生產菌原生質體制備與再生條件的研究

張方方　劉海元　張曉瓊等

摘要：為高效獲得內生真菌U29、U32、U50、U51石杉堿甲生產菌株的原生質體和為原生質體融合及基因組改組選育高產石杉堿甲菌株提供參考，研究了溶解酶的濃度、加酶量、酶解溫度、穩定劑等因子對4株菌原生質體制備的影響。通過研究獲得了菌株原生質體制備的優化條件：溶壁酶濃度為3.0%、加酶量為2.0 mL/100 mg、菌齡為5 d、酶解時間為2.5 h、酶解溫度為30 ℃、0.6 mol/mL氯化鈉為穩定劑、CYM培養基為再生培養基。在此優化條件下，4株菌的原生質體的產量均大于7.0×107 個/mL，再生率可達20%以上。

關鍵詞：內生真菌；溶解酶；原生質體制備；原生質體再生

中圖分類號： S336文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2015）11-0085-05

收稿日期：2015-05-14

基金項目：福建省社會發展引導性項目（編號：2015Y01010244）；福建省財政廳專項經費[編號：閩財指（2011）1238]；福建省大學生創新創業項目（編號：201310393057）。

作者簡介：張方方（1990—），女，碩士研究生，主要從事中藥生物工程研究。E-mail：1170563131@qq.com。

通信作者：吳水生，從事中藥生物工程研究。E-mial：wushuishengwss@163.com。石杉堿甲 （huperzine A，HupA） 是20世紀80年代，我國學者從藥用植物蛇足石杉[Huperziaserrata （Thunb.） Trev.]中分離到的一種石松類倍半萜生物堿，具有高效、低毒、可逆性的乙酰膽堿酯酶抑制作用，目前已成為治療阿爾茨海默病最有效的藥物之一[1-3]。

內生真菌長期生活在植物體內能夠產生與宿主植物相同或相似的化學成分[4]。自從1996年Strobel等[5]從短葉紅豆杉中分離到1株產紫杉醇的內生真菌，利用內生真菌生產化合物被人們廣泛接受[6]。筆者從閩澤馬尾杉中分離到1株產石杉堿甲的內生真菌炭團菌NX9，但產量僅為1.12 μg/L，經紫外誘變得到4株產量較高的石杉堿甲生產菌U29、U32、U50、U51，產量分別為17.10、17.46、19.89、16.85 μg/L，但該產量仍較低無法實現工業化生產。通過菌種選育獲得產量高、遺傳穩定性好的菌種是實現利用內生真菌發酵生產石杉堿甲的首要前提。

原生質體育種能夠快速、有效地提高菌株中代謝產物的產量，包括原生質體再生育種、原生質體誘變育種、原生質體融合育種等方法[7]。Jin等以10株產量較高的多殺菌素產生菌（Saccharopolyspora spinosa）為出發菌株，進行原生質體融合后獲得的融合菌株S. spinosa 4～7，其多殺菌素產量比出發菌株提高了200.55%以上[8]。2002年出現的基因組改組技術則是在原生質體融合的基礎上通過對正向突變株庫進行多親本的原生質體遞推式融合而實現高效的定向育種，極大地加快了獲得高產、穩產的菌株的速度[9]。制備大量有活性的原生質體是原生質體融合及基因組改組育種的前提[7]。有效的原生質體制備和再生方法是保證原主質體產量和活性的主要途徑，原生質體的制備和再生主要受酶的種類與濃度、酶解時間與溫度、菌齡、滲透壓穩定劑、培養基成分等因素[10-11]的影響，且由于菌株間存在的差異性，導致原生質體制備和再生的方法存在差異[12]。優化原生質體制備及再生的最優條件是原生質體育種的重要方法。為此，本試驗研究了溶解酶的濃度、加酶量、酶解溫度、穩定劑、再生條件等對內生真菌U29、U32、U50、U51石杉堿甲生產菌株的原生質體制備效率的影響，旨在篩選出適合產石杉堿甲內生真菌的原生質體制備與再生的最優條件，為原生質體育種及基因組改組育種奠定基礎，最終為微生物發酵法生產石杉堿甲且早日實現工業化生產奠定基礎，從根本上解決石杉堿甲藥源不足的問題。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1菌種石杉堿甲產生菌U29、U32、U50、U51：由石杉堿甲產生菌NX9誘變所得，實驗室保藏。

1.1.2培養基的配制（1） PDA液體培養基：馬鈴薯200 g/L；葡萄糖20 g/L。（2） PDA固體培養基：馬鈴薯200 g/L；葡萄糖20 g/L；瓊脂15～20 g/L。（3）查氏培養基：蔗糖30 g/L；硝酸鈉3 g/L；磷酸二氫鉀1 g/L；氯化鉀0.5 g/L；硫酸鎂0.5 g/L；硫酸亞鐵0.001 g/L；瓊脂16 g/L。（4）CYM培養基：蛋白胨2 g/L；葡萄糖20 g/L；酵母膏2 g/L；硫酸鎂5 g/L；磷酸二氫鉀0.46 g/L；磷酸氫二鉀1 g/L；瓊脂16 g/L。（5） MYG培養基：麥芽糖5 g/L；酵母膏5 g/L；葡萄糖10 g/L。（6）酵母膏培養基：酵母膏5 g/L；蔗糖10 g/L。（7）再生固體培養基：以0.6 mol/L NaCl配制的PDA培養基、馬丁培養基、查氏培養基、CYM培養基和酵母膏培養基。（8）再生半固體培養基：再生培養基中瓊脂減半。所有培養基均以121 ℃，滅菌20 min。

1.1.3試劑溶壁酶（美國sigma公司）；氯化鈉、蔗糖、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、氯化鉀、硫酸鎂、硫酸亞鐵、硝酸鈉（國藥集團化學試劑有限公司）；酵母膏 （廣東江門生物技術開發中心有限公司）；蛋白胨 （廣西環凱微生物科技有限公司）。

滲透壓穩定劑：采用0.6 mol/L的NaCl溶液。HupA標準品（純度>98%，長沙中仁生物技術有限公司，批號：2012120301）。

1.1.4儀器與設備MJP-250型霉菌培養箱（上海精宏實驗設備有限公司），BSC-1360ⅡA2超凈工作臺（北京東聯哈爾儀器制造有限公司），超高效液相質譜儀（Waters，Milford，MA，USA），ACQUITY UPLC BEH C18反相柱（Waters，100 mm×2.1 mm，1.7 μm）。

1.2方法

1.2.1菌絲體培養將菌株U29、U32、U50、U51孢子液以10%（體積比）的接種量接種于含80 mL PDA液體培養基的250 mL三角搖瓶中，于28 ℃恒溫箱中靜置培養5 d，6層高級擦鏡紙過濾，0.6 mol/L NaCl溶液淋洗3次，將菌絲體轉移到直徑為6 cm培養皿中，稱質量待用。

1.2.2原生質體的制備、純化與再生每100 mg菌絲體加 2 mL 酶解液，于適宜溫度的恒溫搖床中振蕩酶解。每30 min吸取一定量的酶解液觀察，計算原生質體數。酶解完畢后，酶解液用無菌棉花過濾，于3 700 r/min離心10 min，倒掉上清液，用滲透壓穩定劑離心洗滌2次，收集原生質體重懸于滲透壓穩定劑中，血球計數板計數。用滲透壓穩定劑稀釋原生質體，使之達到一定濃度，然后吸取0.3 mL加入含有4.7 mL再生半固體培養基的具塞試管中，搖勻后倒入再生固體培養基平板內，于28 ℃下培養7 d；同時，再吸取0.3 mL原生質體懸液加入已含有4.7 mL低滲半固體培養基的具塞試管中，搖勻后倒入PDA固體培養基平板，作為對照。觀察菌落生長情況，用以下公式計算再生率：再生率=（再生固體培養基上菌落數-低滲固體培養基上菌落數）/原生質體數×100%。分別考察不同的溶解酶濃度、加酶量、菌齡、酶解時間、酶解溫度、滲透壓穩定劑及濃度、再生培養基對原生質體制備與再生的影響。每個影響因素均平行考察3份，結果取平均值，獲得石杉堿甲生產菌原生質體形成和再生的最佳條件。

2結果與分析

2.1酶濃度的選擇

分別采用2.0%、2.5%、3.0%、3.5%的溶壁酶酶解菌株U29、U32、U50、U51的菌絲體，在其他條件一致的情況下通過計算其原生質體的產量與再生率，考察原生質體制備與再生的最適酶濃度。發現溶壁酶濃度由2.0%至3.0%時石杉堿甲生產菌的原生質體產量及再生率均增大，雖然溶解酶濃度為35%時4株菌的原生質體產量均較大，但是原生質體的再生率卻比3.0%時低，因此確定溶解酶的濃度為3.0%（表1）。

2.2加酶量的選擇

分別將100 mg新鮮菌絲體加入1.0、2.0、3.0、3.5、4.0 mL 的酶液，溶解酶濃度為3.0%，研究加酶量對4株菌的原生質體產量及再生率的影響。加入的酶液過多或過少都難以得到最大量的原生質體，當加酶量為2.0 mL/100 mg時，4株菌的原生質體產量及再生率均達到最大（表2），因此確定最適宜的加酶量為2.0 mL/100 mg。

2.3菌齡的選擇

將3.0%溶壁酶分別加入靜止培養3、4、5、6、7 d的U29、U32、U50、U51菌絲體，加酶量2.0 mL/100 mg，考察菌齡對原表2加酶量對菌U29、U32、U50、U51原生質體產量及再生率的影響生質體產量和再生率的影響。發現隨著菌齡的增加，4株菌的原生質體產量及再生率均增大，但培養時間過長原生質體產量及再生率均下降。當培養時間為5 d時，原生質體的產量及再生率均最大（表3），因此確定最佳菌齡為5 d。

2.4酶解時間的研究

在確定的最佳酶濃度、加酶量及菌齡條件下，分別研究了酶解1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5 h后的原生質體產量及再生情況。發現酶解時間過短會導致細胞壁水解不充分，原生質體不能充分釋放，產量較低，但原生質體活性較高，再生率較高；而酶解時間過長導致了原生質體皺縮，損害細胞質膜導致再生率急劇下降[13]。其中酶解2.5 h時4株菌的原生質體產量及再生率均達最大（表4）。因此，確定2.5 h為最佳酶解時間。

2.5酶解溫度的選擇

在上述最佳條件下，分別將U29、U32、U50、U51菌絲體置于26、28、30、32、34 ℃的恒溫搖床中，在70 r/min條件下酶解2.5 h后對原生質體產量和再生率進行分析。發現當酶解溫度為28～30 ℃時，原生質體產量與再生率隨溫度升高而增大，溫度高于30 ℃后，4株菌的原生質體產量與再生率均明顯下降（表5）。

2.6滲透壓緩沖劑的選擇

在上述最佳條件下，分別研究了氯化鉀、氯化鈉、蔗糖、甘露醇、硫酸鎂、氯化鈣等滲透壓緩沖劑對菌U29、U32、U50、U51原生質體產量及再生率的影響。發現當酶濃度為30%、菌齡為5 d、酶解時間為2.5 h、酶解溫度為30 ℃時，以氯化鈉作為滲透壓穩定劑制備4株菌的原生質體時，原生質體產量及再生率均最大，故選用氯化鈉為最佳的滲透壓穩定劑（表6）。此外，研究了不同濃度氯化鈉對菌U29、U32、U50、U51原生質體產量與再生率的影響，發現氯化鈉濃度在0.4～0.6 mol/L時，4株菌的原生質體產量及再生率隨濃度的增大而增大，當濃度大于0.6 mol/L時，產量及再生率均下降（表7）。

2.7再生培養基的選擇

采用上面研究所得最優條件制備4株菌的原生質體，然后分別將其接種到PDA、CYM、MYG、沙氏、酵母膏等再生培養基進行培養。發現不同培養基其再生率明顯不同，以CYM再生培養基培養U29、U32、U50、U51原生質體時，再生率最高（圖1）。因此，確定最佳的再生培養基為CYM培養基。

2.8原生質體的觀察

4株菌菌絲體經溶壁酶在30 ℃作用下，恒溫振蕩處理約30 min后開始釋放出原生質體，原生質體形狀基本一致，多呈球形、透亮，同時可觀察到大量菌絲片段（圖2）。

3討論

3.1酶濃度及加酶量對原生質體產量及再生率的影響

真菌細胞壁組分復雜，不同培養條件和不同菌齡細胞壁的結構和成分差異很大，而且酶解真菌細胞壁的過程還涉及到多個影響因素，本研究通過研究溶壁酶濃度、加酶量、菌齡、培養時間等因子對4株石杉堿甲生產菌原生質體制備的影響，獲得了制備4株菌原生質體的最優條件。

真菌細胞壁的主要成分包括幾丁質、糖原、蛋白質、半纖維素等。在形成原生質體的過程中，細胞壁被溶解酶酶解出孔洞，原生質體從這些孔洞中溢到周圍的穩滲劑中。因此，細胞壁溶解酶在真菌制備原生質體的反應系統中起直接作用[14]。吳正鋼等研究發現采用單一酶制備原生質體，消除細胞壁不完全只能形成少量的原生質體[15]，但本研究通過考察單一溶壁酶不同濃度對4株菌原生質體形成與再生的影響，研究發現溶壁酶的濃度應適當，過低或過高的酶濃度都不利于原生質體的形成與再生。低濃度的溶壁酶酶解作用不徹底，不利于原生質體的生成，過高濃度降低了原生質體的數量和活性，致使形成量與再生率都有明顯下降。當酶濃度為30%時，原生質體的產量均大于6.0×107個/mL，再生率均大于16%，比采用復合酶系制備原生質體的產量及再生率高[14-15]，不僅簡化了試驗步驟而且節約成本。

加酶量對提高原生質體的產量及再生率的影響也較大，過大或過小都難以得到最大量的原生質體。加酶量過少酶解不徹底，菌絲中的原生質體無法得到充分的釋放，且影響原生質體的活性，降低再生率。

3.2菌齡對原生質體制備及再生率的影響

真菌生理狀態是決定原生質體產量及再生率的主要因素之一，不同的生長時期，真菌生理狀態不同，細胞壁的結構、菌體活力及代謝水平也不相同。因此，菌齡是明顯影響原生質體釋放頻率的主要因素。絲狀真菌以年輕的菌絲用來分離原生質體最佳，尤其是生長對數期的菌體。本研究通過繪制4株菌的生長曲線，發現4株菌的對數生長期均為3～7 d，幼齡菌絲和老齡菌絲均不利于酶解。菌齡過長，細胞壁發生老化增厚，不易釋放原生質體，菌齡過短則菌絲體易破裂[16]。研究還發現3～5 d的菌體隨著培養時間的增加，原生質體產量及再生率均提高，當菌齡為5 d時，原生質體產量及再生率均達最大值，隨后逐漸降低。

3.3酶解溫度對原生質體制備及再生率的影響

不同的酶具有不同的最適溫度，酶解溫度直接影響酶的活性。只有在最適的酶解溫度下，酶的活性才最高，酶促反應速率才最大。此外，酶解溫度還影響真菌的生理狀態、菌絲體細胞壁結構性疏散及原生質體的活力。通常，真菌的最適酶解溫度為25～35 ℃，當溫度在30 ℃時，4株菌原生質體的產量及再生率均達最大值，表明30 ℃為溶壁酶作用4株菌細胞壁的最適溫度。

3.4不同滲透壓穩定劑對原生質體制備及再生的影響

滲透壓穩定劑既能維持原生質體內外滲透壓的平衡，維持原生質體的形態，防止破裂或皺縮，影響原生質體活力，對酶的活性也有一定的促進作用，是影響原生質體制備與再生的重要因素。研究發現6種常用穩定劑中，以0.6 mol/L氯化鈉為滲透壓穩定劑時，4株菌的原生質體制備效果最好，可能由于氯化鈉等有助于酶與底物結合，對酶反應起促進作用[17]。

3.5不同再生培養基對原生質體再生的影響

再生培養基的選擇直接影響原生質體的再生率。本研究比較了PDA、CYM、MYG、酵母等5種再生培養基對4株菌原生質體再生率的影響，發現CYM再生培養基效果最好。可能由于酵母膏、蛋白質、氨基酸、糖類等營養物質可能是細胞壁合成的前體物質，或經過代謝轉化成細胞壁的前體物質，或促進細胞代謝，參與細胞壁的加速合成。CYM培養基中同時含有酵母膏、蛋白質、氨基酸、糖類，豐富的營養物質更有利于細胞壁再生。

4結論

本試驗研究了4株石杉堿甲生產菌原生質體制備及再生的條件，獲得了原生質體制備及再生的最優體系：溶壁酶濃度為3.0%、加酶量為2.0 mL/100 mg、菌齡為5 d、酶解時間為2.5 h、酶解溫度為30 ℃、0.6 mol/L氯化鈉為穩定劑、CYM培養基為再生培養基。在此體系下，4株菌原生質體的產量均大于7.0×107個/mL，再生率均超過20%。本研究為原生質體融合及基因組改組選育高產石杉堿甲菌株奠定了重要基礎。

參考文獻：

[1]徐擇鄰，儲賓孟，欒新慧，等. 福定堿（fordine）的結構測定[J]. 軍事醫學科學院院刊，1985（3）：222.

[2]劉嘉森，俞超美，周有作，等. 石杉堿甲和石杉堿乙的化學研究[J]. 化學學報，1986，44（10）：1035-1040.

[3]Rafii M S，Walsh S，Little J T，et al. A phase Ⅱ trial of huperzine A in mild to moderate Alzheimer disease[J]. Neurology，2011，76（16）：1389-1394.

[4]Li J，Zhao J L，Xu L J，et al. Endophytic fungi from rhizomes of Paris polyphylla var. yunnanensis[J]. World Journal of Microbiology and Biotechnology，2008，24（5）：733-737.

[5]Strobel G，Yang X，Sears J，et al. Taxol from Pestalotiopsis microspora，an endophytic fungus of Taxus wallachiana[J]. Microbiology，1996，142（Pt 2）：435-440.

[6]Strobel G，Daisy B. Bioprospecting for microbial endophytes and their natural products[J]. Microbiology and Molecular Biology Reviews，2003，67（4）：491-502.

[7]施巧琴，吳松剛. 工業微生物育種學[M]. 北京：科學出版社，2009：228.

[8]Jin Z H，Xu B，Lin S Z，et al. Enhanced production of spinosad in Saccharopolyspora spinosa by genome shuffling[J]. Applied Biochemistry and Biotechnology，2009，159（3）：655-663.

[9]李義勇，張亞雄. 基因重組技術在工業微生物菌種選育中應用的研究進展[J]. 中國釀造，2009（1）：11-14.

[10]邱靜，羅水忠，姜紹通，等. 高產L-乳酸米根霉的原生質體制備與再生條件研究[J]. 食品科學，2011，32（9）：174-178.

[11]陳文強，鄧百萬，彭浩，等. 1株產紫杉醇內生真菌的原生質體制備與再生[J]. 江蘇農業科學，2011，39（2）：100-102.

[12]伏建國，強勝，朱云枝. 鏈格孢菌原生質體的制備與限制性內切酶介導整合（REMI）轉化的致病性誘變[J]. 菌物學報，2005，24（3）：407-413.

[13]鄭重誼，謝達平，譚周進，等. 影響微生物原生質體融合技術的因素[J]. 湖南農業科學，2006（4）：35-38.

[14]周選圍，王子楠，魏雅敏，等. 紅豆杉內生真菌發酵培養基和原生質體制備酶系統的篩選[J]. 應用與環境生物學報，2006，12（2）：176-181.

[15]吳正鋼，汪捷，謝薇薇，等. 禾本科內生真菌研究15：禾本科內生真菌Epichloё yangzii原生質體的制備與再生[J]. 江蘇農業科學，2012，40（2）：17-20.

[16]王衛衛，任鵬康，郭宏星. γ-亞麻酸菌株少根根霉原生質體形成與再生[J]. 西北大學學報：自然科學版，2002，32（4）：397-400.

[17]諸葛斌，諸葛健. 現代發酵微生物實驗技術[M]. 北京：化學工業出版社，2005：110-111.施帥男，陸葉，楊金海，等. 紅楓品種“四季紅”休眠芽萌發誘導與培養[J]. 江蘇農業科學，2015，43（11：90-92.