水楊酸浸種對NaCl脅迫下黍稷種子萌發時α—淀粉酶活性的影響

張美玲　劉克鋒

摘要：以黍稷為試驗材料，研究在不同的浸種溫度、浸種時間、水楊酸濃度對α-淀粉酶活性影響的基礎上，利用響應面分析法優化設計處理試驗所得數據，以確定黍稷萌發時α-淀粉酶活性最高時的參數。試驗結果表明，最優的參數溫度為31.3 ℃、時間為18.44 h、水楊酸濃度為0.461 9 mmol/L，在這樣的優化條件下，α-淀粉酶活性的理論值為0.461 9，與理論值的貼近度達97.79%。

關鍵詞：黍稷；水楊酸；浸種；NaCl脅迫；α-淀粉酶活性；響應面分析

中圖分類號： S516.01文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2015）11-0149-04

收稿日期：2014-11-01

基金項目：國家自然科學基金（編號：31100509）；北京市教育委員會科技計劃面上項目 （編號：KM201210020005）；國家現代農業科技城成果惠民科技示范工程（編號：Z121100007412003）。

作者簡介：張美玲（1988—），女，山西大同人，碩士研究生，研究方向為園林植物栽培生理與生態。E-mail：1004990855@qq.com。

通信作者：劉克鋒，碩士，研究員，主要從事土壤肥料及花卉栽培、引種選育、工廠化標準育苗方面的研究。E-mail：liukefeng006@163.com。鹽脅迫是指植物生長在濃度比較高的鹽土壤中，由于高濃度的鹽對其有很大的影響而生長不良。人類賴以生存的這片大地一直受到土壤高含鹽量的困擾，中國高含鹽量土壤主要分布在黑龍江、河北、山西、西北等一些地區，近年來，設施大棚生產較多，同時設施內土壤含鹽量也在逐漸增加，產量逐年下降，大田種植中這種情況發生也很普遍，土壤鹽漬化已成為農業生產的主要阻礙因素之一。通過采取相應的化學技術措施可以有效減少鹽脅迫對植物的危害，增強作物在高鹽度情況下也能良好生長，使得作物的收獲量穩定增加，而且每年總收獲量能呈現出上升趨勢。水楊酸（SA）是植物體內產生的一種簡單酚類化合物，即鄰羥基苯甲酸，廣泛存在于高等植物中[1]。水楊酸浸種能夠減弱高鹽含量對黍稷的危害，使其對鹽脅迫的適應性提高。黍稷是中國常見的種植農作物之一，在經歷了很長的農業種植歷史后，形成了品種種類繁多的種質資源。黍稷屬于禾本科（Gramineae）黍屬一年生草本植物。本試驗在NaCl脅迫下，研究不同水楊酸濃度浸種對黍稷種子萌發時α-淀粉酶活性的影響，篩選合適的水楊酸濃度、浸種溫度、浸種時間，為在高鹽條件下黍稷的抗鹽栽培提供技術依據。1材料與方法

1.1材料與試劑

供試種子為黍稷原平農20；試劑：檸檬酸緩沖液、3，5-二硝基水楊酸（DNS）、高錳酸鉀、麥芽糖標準溶液[2]、淀粉溶液、四水硝酸鈣、硝酸鉀、硝酸銨、磷酸二氫鉀、硫酸鎂、鐵鹽溶液（乙二胺四乙酸二鈉和七水硫酸亞鐵）、碘化鉀、硼酸、硫酸錳、硫酸鋅、鉬酸鈉、硫酸銅[3]、氯化鈷。

1.2儀器與設備

722型可見分光光度計（上海菁華科技儀器有限公司），Anke TDL-40B離心機，電熱恒溫干燥箱，恒溫水浴箱。

1.3試驗方法

1.3.1浸種溫度、浸種時間、水楊酸濃度確定水楊酸濃度為0.25、0.50、0.75、1.00、1.25 mmol/L 5個濃度；試驗溫度為10、20、30、40、50 ℃；時間為10、14、18、22、26 h。

1.3.2α-淀粉酶活性的測定

1.3.2.1標準曲線的制作[4]取試管7支，每支刻度為25 mL，各種試劑添加量見表1。試劑混合均勻，在沸騰的水中加熱5 min之后，取出冷卻，注入蒸餾水定容至20 mL，振動均勻。把1號管定為CK，整到零，D540 nm波長下比色。由此得出麥芽糖的方程為y=0.262 7x-0.016 8，r2=0.986 8，式中：y表示吸光度，x表示麥芽糖含量。麥芽糖標準曲線見圖1。

1.3.2.2α-淀粉酶的提取稱取0.5 g萌發3～5 d的黍稷種子（芽長1.5～2.0 cm），放在研缽里，加少量的二氧化硅和1 mL蒸餾水，研磨至勻漿。把勻漿倒在50 mL容量瓶中，用蒸餾水將剩余物洗3次倒在容量瓶中，添加蒸餾水定容到50 mL。放在常溫下15～20 min以利于充分提取，每隔 1～2 min搖動1次，使其完全提取。之后取少量溶液在3 000 r/min的離心機下，離心10 min，上面清澈的液體就是淀粉酶原液。

1.3.2.3α-淀粉酶活性的測定清洗試管6支，分別標明3支為對照，3支為測定管；每個試管中加入1 mL的酶提取液，在69.5～70.5 ℃下加熱15 min，降低β-淀粉酶，拿出每支管后用自來水冷卻；各試管中加入0.1 mol/L、pH值5.6的檸檬酸提取液1 mL；對照管加入4 mL 0.4 mol/L NaOH溶液，以鈍化酶的活性。再加入1%淀粉溶液2 mL，混勻；把測定管放于39.5～40.5 ℃恒溫水浴中保溫15 min后，向其中注入40 ℃下預熱的1%淀粉溶液2 mL。振動均勻并立刻放回40 ℃水浴中保溫5 min，拿出試管后立即注入0.4 mol/L NaOH 4 mL，然后準備下步糖的測定。

樣品測定：吸取上面每個試管中酶反應之后的液體及對照管中的液體分別為2 mL，然后加入到25 mL具塞試管刻度中，再注入DNS試劑2 mL，混合均勻，放到沸騰水中加熱15 min，拿出冷卻，注入蒸餾水稀釋至20 mL，振動均勻后，在D540 nm下對比色，記下吸光度，計算麥芽糖的量，并由以下公式計算酶活性。

結果計算：淀粉酶活性以每克鮮質量所含麥芽糖毫克數表示[mg/（g·min）]。

α-淀粉酶=（A-A′）×Vt/（m×Vs×t ）。

式中：A表示酶水解淀粉變為糖；A′表示淀粉酶CK管里糖含量；Vt表示樣品的稀釋液總體積；m表示樣品的鮮質量（g）；Vs表示顯色時所用的酶液體積；t表示酶作用的時間（min）。

1.3.3響應面優化設計響應面優化設計是利用合理的試驗設計方法并通過試驗得到的數據，采用多元二次回歸方程擬合因素與響應值之間的函數關系，通過對回歸方程的分析尋求最優工藝參數，解決多變量問題的一種統計方法[5-7]。

在不同的水楊酸濃度、浸種溫度、浸種時間單因素試驗結果的基礎上，用Design-Expert.V8.0.6軟件[8]對其中重要的3個因素進行響應面分析（表2），進一步優化α-淀粉酶活性的參數。

1.4統計與分析

單因素試驗數據的顯著性用“x±s”來表示，采用Excel、SAS等軟件進行統計分析與制作圖表。

2結果與分析

2.1單因素試驗

2.1.1不同浸種溫度對黍稷發芽時α-淀粉酶活性的影響設定水楊酸的濃度為1.0 mmol/L，浸種溫度為18 h，比較不同的浸種溫度（10、20、30、40、50 ℃）在含鹽量較高的土壤逆境中對黍稷長芽時α-淀粉酶活性的影響，結果見圖2。從圖2可以看出，α-淀粉酶的活性受浸種溫度的影響，α-淀粉酶的活性隨著浸種溫度的上升而提高，當溫度為30 ℃時，α-淀粉酶的活性最高，隨著浸種溫度的上升，α-淀粉酶的活性下降。因此，α-淀粉酶活性最高時浸種溫度為30 ℃。

分析結果，淀粉酶活性溫度為30 ℃顯著高于20、10、50 ℃；40 ℃顯著高于10、20 ℃；50 ℃顯著高于10 ℃，其他處理間差異不顯著。

2.1.2不同浸種時間對黍稷α-淀粉酶活性的影響設定水楊酸濃度為1.0 mmol/L，浸種溫度為30 ℃，比較不同的浸種時間（10、14、18、22、26 h）在鹽逆境條件下對黍稷α-淀粉酶的活力的影響，結果見圖3。

從圖3可以看出，α-淀粉酶的活性隨著浸種時間的延長顯示出上升的趨勢，試驗時間達18 h時為最大值，繼續增加反應時間，α-淀粉酶的活性呈下降趨勢。因此，浸種時間為18 h時α-淀粉酶活性最高。

多重比較結果：淀粉酶活性浸種18、14 h顯著高于22、10、26 h；22 h顯著于10、26 h，其他處理之間差異不顯著。

2.1.3不同水楊酸濃度對黍稷發芽時α-淀粉酶活性的影響設定浸種溫度為30 ℃，浸種時間為18 h，比較不同水楊酸濃度（0.25、0.50、0.75、1.00、1.25 mmol/L）在鹽脅迫下對黍稷種子萌發的α-淀粉酶活性的影響，結果見圖4。

增加也漸漸增大，當濃度達到0.5 mmol/L時，活性最大。因此，水楊酸濃度為0.5 mmol/L α-淀粉酶活性最高。

多重比較結果，淀粉酶活性當水楊酸濃度為0.5 mmol/L顯著高于 0.25、1.00、1.25 mmol/L，其他處理間差異不顯著。

2.2響應面優化

2.2.1響應面優化設計結果綜合單因素的試驗結果，選擇對α-淀粉酶的活性產生影響較大的水楊酸濃度、浸種溫度、浸種時間，進行響應面試驗設計并應用軟件Design-Expert 8.0.6來分析處理數據，結果見表3。

因素 X1（浸種溫度）、X3（水楊酸濃度）對α-淀粉酶活性的影響的線性效應 P <0.01，是極顯著，而X2（浸種時間）是顯著，X1X2、X2X3對α-淀粉酶活性的交互影響是顯著，而 X1X3不顯著，但X12、X22、 X32的曲面效應都極顯著，說明各個因素與響應值之間沒有表現出簡單的線性關系，可由單因素F值的大小判斷各因素對α-淀粉酶活性的作用次序，由此得出強弱的次序為浸種溫度>水楊酸濃度>浸種時間。

2.2.2不同處理間的多重比較從表4可以看出：在建立的數學回歸模型中，在α=0.05水平上，X1與X2 、X2 與 X3 交互作用顯著，而 X1與X3交互作用不顯著，依據數據，作出X1X2和X2 X3的等高線圖和三維空間響應面圖[9]，據此可分析和評價雙因素交互作用的影響（圖5、圖6）。水楊酸濃度一定時，時間與溫度的交互作用顯著，當水楊酸濃度在零水平時，即0.5 mmol/L 時，隨著時間與溫度的增加，α-淀粉酶活性顯著增大，隨后呈下降趨勢，坡度較緩；當溫度在零水平上時，即為30 ℃ 時，水楊酸濃度與時間的交互作用表現顯著，響應值隨著水楊酸濃度與時間變大而漸漸升高，當為最大值之后，α-淀粉酶活性反而跟著處理的增高而降低，經軟件分析α-淀粉酶活性的最佳件：溫度31.3 ℃，時間18.44 h，水楊酸濃度0.472 5 mmol/L，在此條件下，α-淀粉酶活性的理論值為0.461 876。綜合實際操作，α-淀粉酶活性的最佳條件為：溫度30 ℃，時間18 h，水楊酸濃度0. 5 mmol/L，與理論值的貼近度達97.79%。

3結論

以黍稷為原料，從不同的溫度、時間、水楊酸濃度3個方

面考慮α-淀粉酶活性。由回歸模型方差比較結果，浸種溫度、浸種時間和水楊酸濃度對α-淀粉酶活性的影響的強弱順序依次為浸種溫度>水楊酸濃度>浸種時間。根據單因素試驗結果，對參數采用響應面試驗的方法處理數字，即黍稷種子萌發時α-淀粉酶活性在水楊酸濃度為0.472 5 mmol/L、溫度為31.3 ℃、時間為18.44 h的試驗條件下，α-淀粉酶活性為0.461 9，與理論值的貼近度為97.79%。

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