2種harpin內源表達對短短芽孢桿菌HAB—5菌株抑制和促生能力的影響

汪惠　謝琳琳　劉文波等

摘要：采用化學方法分別將來自水稻白葉枯病菌（Xanthomonas oryzae pv. oryzae）、棉花角斑病菌（X. citri subsp. malvacearum）hrp基因簇中的hpa1Xoo、hpaXm基因轉化至生防菌短短芽孢桿菌（Brevibacillus brevs）HAB-5菌株，測定2種harpin蛋白對短短芽孢桿菌抑菌和促生能力的影響，以期獲得更高效的生防菌株。結果表明，獲得轉入hpa1Xoo的突變體581個，轉入hpaXm的突變體有650個；經PCR及PCR Southern Blot驗證，確定hpa1Xoo、hpaXm基因均成功轉化至HAB-5菌株中；經SDS-PAGE電泳，在分子量大小約39、41 ku處可見明顯條帶，表明hpa1Xoo、hpaXm基因分別編碼的融合蛋白GST-harpinXoo、GST-harpinXm在突變體菌株中得到表達；與出發菌株HAB-5菌株相比，轉化后的突變體在菌落形態、拮抗活性上均發生了改變，且突變體總蛋白可在煙草葉片上激發過敏性反應，而HAB-5菌株總蛋白不能激發過敏性反應；突變體菌株對番茄種子的促生作用顯著提高，且轉入hpaXm基因的菌株效果更佳，使胚芽、胚根的生長分別提高100.77%、69.14%。可見，harpin能夠在短短芽孢桿菌HAB-5菌株中得到表達，且轉化后的突變體表現出良好的促生效果。

關鍵詞：hpa1Xoo；hpaXm；轉化；短短芽孢桿菌HAB-5；過敏性反應

中圖分類號： S476文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2015）11-0161-06

收稿日期：2015-01-25

基金項目：國家自然科學基金（編號：31160359、31360029）；海南省產學研一體化專項（編號：CXY20140038）；海南大學社會服務專項（編號：HDSF201305）；教育部博士點基金（編號：20124601110004、20104601110004）；國家農業產業技術體系建設專項（編號：CARS-34-GW8）；國家重大基礎研究計劃（編號：2011CB111612）。

作者簡介：汪惠（1991—），女，碩士研究生，主要從事微生物學研究。

通信作者：鄭服叢，教授，主要從事植物病理學研究。E-mail：zhengfucong@126.com。harpin是一類由革蘭氏陰性植物病原細菌hrp基因編碼的蛋白質，由不依賴信號肽的Ⅲ型分泌機制分泌到胞外，可在非寄主植物上引起過敏反應（hypersensitive response，HR）[1-3]。在非寄主植物上施用Harpin蛋白，可使植物產生抗病、抗蟲、促進生長等多種有益表型[4]，這些表型與harpin蛋白誘導的植物內在生理生化反應相關[5]。harpin蛋白富含甘氨酸，缺乏半胱氨酸，熱穩定但對蛋白酶敏感[6]。harpinXoo、harpinXm是由分別來自于水稻白葉枯病菌（Xanthomonas oryzae pv. oryzae）、棉花角斑病菌（X. citri ssp. malvacearum）hrp基因簇中hpa1（hrf1）基因編碼的蛋白，均具有harpin蛋白的共同特征，且能誘導煙草、擬南芥、番茄、矮牽牛、馬鈴薯、大豆、黃瓜、辣椒等多種植物產生過敏性反應[7-8]。

芽孢桿菌作為一種較理想的生防微生物，逐漸成為近年來研究的熱點[9]。通過基因工程技術有目的地改造拮抗細菌，拓寬新型高效生防菌的防治范圍并提高生防效果，已成為植物病害生物防治研究的重點[10]。目前，已有學者將編碼harpin蛋白的hrp基因轉入枯草芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌中，使出發菌株具有harpin蛋白的部分特性[11-12]。以短短芽孢桿菌作為表達系統是研究熱點，但其表達harpin蛋白卻未見報道。短短芽孢桿菌（Brevibacillus brevs）HAB-5菌株是一種較廣譜的生防細菌，對多種病原菌表現出較強的抑制能力，但該菌株不具有誘導抗病能力和穩定有效的促生效果[13]。把編碼harpin蛋白誘導植物系統抗性的hrp基因轉化到生防菌芽孢桿菌中，以期實現harpin蛋白在短短芽孢桿菌中的高效表達，獲得更高效的生防菌株，為新型生物農藥的開發利用提供基礎。

1材料與方法

1.1供試菌株、培養基、植物材料

供試菌株為HAB-5菌株，是筆者所在實驗室從棉花根際土壤中分離獲得的1株短短芽孢桿菌[13]。大腸桿菌（Escherichia coli）菌株BL21（DE3）作為重組融合蛋白GST-harpinXoo、GST-harpinXm表達的宿主菌株，具有氨芐青霉素抗性（Amp，100 mg/mL），表達的重組融合蛋白GST-harpinXoo、GST-harpinXm的分子量大小分別為39、41 ku左右。芒果炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides Penz.）C7-2菌株來自筆者所在實驗室，用于拮抗測定。

LB培養基[14]用于HAB-5菌株、突變體菌株的培養；PDA培養基[14]用于供試病原真菌、HAB-5菌株、突變體菌株的對峙培養。MD培養基[15]（10 mL）配方為：10×PC緩沖液0.92 mL、50%葡萄糖0.1 mL（115 ℃滅菌30 min）、5 mg/mL 色氨酸0.1 mL、2.2 mg/mL檸檬酸鐵銨0.005 mL、05 mol/L天門冬氨酸鉀0.24 mL、1 mol/L硫酸鎂0.03 mL。10×PC緩沖液配方為：磷酸二氫鉀44 mmol/L、磷酸氫二鉀60 mmol/L、檸檬酸三鈉30 mmol/L。

供試煙草品種為三生煙（Nicotiana sp.），于（25±1） ℃培養至5～7葉。番茄（Lycopersicon esculentum Mill.）種子紅粉佳人，購自天津科潤農業科技股份有限公司。

1.2酶、試劑、引物

質粒提取試劑盒、DNA Marker、Taq酶、限制性內切酶、T4 DNA連接酶均購自TaKaRa公司，Southern雜交試劑盒購自美國羅氏公司，分子操作過程均按說明書進行。引物合成、測序均由華大基因公司完成，引物序列見表1。PCR反應體系（總體積25 μL）為：EcoTaq Mix 8.5 μL、DNA模板1 μL、上下游引物各1 μL，并使用滅菌超純水補足至25 μL。PCR反應條件為：95 ℃預變性5 min；95 ℃ 45 s、56 ℃ 45 s、72 ℃ 45 s，共35個循環；72 ℃延伸7 min，于4 ℃保存。對PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳分析，保存圖像。

1.4HAB-5菌株、突變體菌株的菌落形態及其對C7-2菌株的拮抗作用

1.4.1菌落形態觀察用滅菌后的牙簽接菌在LB瓊脂平板上，置于28 ℃培養2 d，觀察菌落形態。

1.4.2對芒果炭疽菌C7-2菌株的拮抗作用采用平板對峙法[16]，在PDA平板中央接種1塊直徑為0.5 cm的病原菌菌餅，在菌餅周圍2.5 cm處接種供試細菌；單獨接種直徑為0.5 cm的病原菌菌餅為對照。將平板置于28 ℃下培養，觀察記錄有無抑菌圈及其大小，并計算抑菌率。抑菌率（%）=（對照病原菌菌落直徑-處理病原菌菌落直徑）/對照病原菌菌落直徑×100%[17]。

1.5粗蛋白的提取及SDS-PAGE電泳

參照繆衛國提取harpin粗蛋白、菌體總蛋白的方法[8]，采用LB液體培養基振蕩培養（160 r/min、28 ℃）菌株12 h，以8 000 r/min下離心10 min收集菌體。將菌體用PBS懸浮，經超聲波破碎儀破碎菌體后于4 ℃、8 000 r/min離心10 min。采用0.22 μm細菌過濾器過濾上清液，獲得粗蛋白，煮沸（100 ℃）10 min進一步純化粗蛋白以檢測harpin蛋白的活性。SDS-PAGE電泳參照汪家政等的方法[18]進行。

1.6煙草過敏性反應及突變體蛋白特性

過敏性反應的測定參照Klement的方法[19]，分別取HAB-5菌株的總蛋白、突變體代表菌株的總蛋白、GST-harpinXoo蛋白、GST-harpinXm蛋白、PBS各50 μL，注射到煙草葉片中，于（25±1） ℃下放置，觀察煙草葉片是否發生過敏性反應。突變體蛋白特性的研究參照諶曉曦等的方法[20]，分別測定菌體粗蛋白在煮沸10 min、強酸堿、蛋白酶K、紫外線等處理下的穩定性。

1.7短短芽孢桿菌HAB-5菌株及其突變體菌株對番茄種子的促生作用

取HAB-5菌株、突變體代表菌株，測試其對番茄種子的促生作用。取搖菌過夜的菌株培養液，于4 ℃、8 000 r/min下離心10 min，棄去上清液。經無菌水清洗后再次離心，并用無菌水調節至D600 nm=0.8，即菌液濃度約為10 億CFU/mL，保存備用。采用無菌水將各菌株菌懸液依次稀釋為1億、0.1億、0.01億、0.001 億CFU/mL等濃度，每個處理濃度3次重復，每個重復10粒番茄種子。種子經溫湯浸種后，置于鋪有單層濾紙的培養皿（9 cm）中，分別向各培養皿中注入5 mL不同濃度的處理液，種子上部再鋪1層濾紙，置于（28±1） ℃恒溫培養箱中。于72 h后觀察發芽勢情況，于96 h后計算發芽率，并測定胚根、胚芽的長度，以根長達到0.2 cm為萌芽標志[21]。試驗中對照均為無菌水。

2結果與分析

2.1突變體菌株的篩選及PCR、PCR Southern Blot驗證

將hpa1Xoo、hpaXm基因轉化HAB-5菌株48 h后，在Amp抗性平板上形成單菌落，作為陽性轉化子，分別獲得轉入hpa1Xoo、hpaXm的轉化子581、650個（圖1-A）。挑取50個陽性轉化子進行PCR驗證，發現在400～500 bp間均可擴增出特異性條帶，經測序比對分別與hpa1Xoo、hpaXm基因序列吻合。其中10個突變體的電泳結果見圖1-B，分別將轉入hpaXm的

突變體命名為B1xm、B2xm、B3xm、B4xm、B5xm，將轉入hpa1Xoo的突變體命名為B1xoo、B2xoo、B3xoo、B4xoo、B5xoo。進行PCR Southern Blot驗證以確保試驗的精確性，可見選取的突變體均產生明顯陽性信號（圖1-C），由此確定hpa1Xoo、hpaXm基因均已成功轉化至HAB-5菌株中。

2.2菌落形態對比

轉化后的突變體在固體LB培養基平板上接種72 h，與HAB-5菌株相比，轉入hpa1Xoo、hpaXm基因的突變體菌落均發生了一定程度的形態變化。HAB-5菌株的菌落呈白色，菌落表面微起皺褶，菌苔邊緣呈波紋狀，不透明，易挑起；轉化后突變體的菌落顏色各異，呈白色或微黃色，菌落表面凸起，半透明且有光澤，質地濕潤，不易挑起。轉hpaXm菌株的菌落較平滑，菌苔邊緣較整齊；轉hpa1Xoo菌株的菌落多呈蛋黃狀，中心凸起，邊緣較平坦，菌苔邊緣多呈不規則狀（圖2）。

2.3突變體對炭疽病C7-2菌株的拮抗作用

對峙培養后，HAB-5菌株及各突變體菌株在培養3、5、7 d 后均對病原菌C7-2菌株產生不同程度的抑制作用，但與HAB-5菌株相比，突變體的拮抗活性均減弱。對峙3 d后產生抑菌帶；對峙5 d后抑菌帶逐漸減弱，但抑菌效果有所增強；對峙7 d后抑菌帶消失，但對病原菌仍有一定程度的抑菌作用（圖3、表2）。

2.4突變體harpin蛋白的表達

從突變體中選取2株代表性菌株B3xm、B5xoo，用作后續研究。細胞破碎提取GST-harpin粗蛋白以及HAB-5、B3xm、B5xoo菌株總蛋白后，經SDS-PAGE電泳，在30～50 ku之間，約39、41 ku位置可見B3xm、B5xoo菌株總蛋白均存在明顯條帶，與GST-harpinXm、GST-harpinXoo相應位置的條帶相同；而在HAB-5菌株總蛋白的泳道相同位置并未出現類似條帶，表明融合蛋白GST-harpinXm、GST-harpinXoo在突變體B3xm、B5xoo菌體內得到表達。此外，與HAB-5菌株相比，B3xm、B5xoo在整個蛋白譜帶上均發生了改變，表明突變體菌株在多肽和蛋白表達的種類、數量上也有很大改變（圖4）。

2.5突變體粗蛋白過敏性反應檢測及其特性

將GST-harpinXoo粗蛋白、GST-harpinXm粗蛋白、B3xm粗蛋白、B5xoo粗蛋白分別注射至煙草葉片中，18 h后均能在煙草葉片上產生過敏性反應，而HAB-5菌株粗蛋白不能產生過敏性反應。分別以100 ℃煮沸10 min、強酸、強堿處理突變體粗蛋白，仍能在18 h內激發HR；經蛋白酶K水解30 min、紫外光照射處理則完全喪失了激發HR的能力，表明突變體表達的harpin蛋白對酸堿不敏感，對熱穩定、紫外線和蛋白酶K敏感，此結論與已報道的GST-harpinXoo、GST-harpinXm粗蛋白特性[8]相同（圖5）。

2.6各菌株對番茄種子的促生效果

與清水對照相比，HAB-5、B3xm、B5xoo不同濃度菌懸液對胚芽、胚根的生長均有顯著性差異。除10 億CFU/mL外，隨著濃度的降低，HAB-5菌懸液的胚芽生長分別比對照高10.85%、24.03%、26.36%、34.11%，胚根生長分別比對照高9.14%、26.29%、29.71%、36.00%，0.001 億CFU/mL 為菌懸液的最適濃度，胚芽、胚根生長分別提高34.11%、36.00%；B3xm菌懸液的胚芽生長分別比對照高100.77%、59.70%、27.13%、44.19%、45.74%，胚根生長分別比對照高

69.14%、28.29%、21.71%、2400%、20.57%，10 億CFU/mL為菌懸液的最適濃度，胚芽、胚根生長分別提高100.77%、69.14%；B5xoo菌懸液的胚芽生長分別比對照高68.21%、54.26%、69.77%、91.47%、46.51%，胚根生長分別比對照高36.86%、2571%、3857%、47.14%、38.86%，0.01億CFU/mL為菌懸液的最適濃度，胚芽、胚根生長分別提高91.47%、4714%。可見，除10億CFU/mL的HAB-5菌懸液外，不同濃度的菌懸液對番茄胚根、胚芽生長均有不同程度的促生作用；與HAB-5菌株相比，轉化后的突變體菌株B3xm、B5xoo對胚芽和胚根的促生作用均有明顯提高，且高濃度菌懸液對番茄種子的生長并無抑制作用（表3）。

3結論與討論

目前，harpin蛋白基因表達宿主主要是大腸桿菌、酵母、芽孢桿菌表達系統。大腸桿菌是經典的蛋白基因表達系統，能夠高水平表達外源蛋白基因，但由于革蘭氏陰性菌細胞壁復雜，具有雙層膜結構，其分泌的水解酶常在信號肽的引導下跨越第1層膜后滯留在周質空間，因而很難將蛋白分泌到胞外；此外，大腸桿菌是一種潛在的病原菌，其生長過程中不斷釋放脂多糖等致熱源物質，為產物的分離和純化帶來巨大困難[22]。酵母菌雖具有一定蛋白翻譯后的加工能力，有利于真核蛋白的表達，但在表達外源基因時會出現產物蛋白不均一、降解、信號肽加工不完全、形成多聚體等問題，蛋白分泌效率低[23]。相對于前兩者，芽孢桿菌表現出很大的優越性。王鈺利用枯草芽孢桿菌表達harpin蛋白，生物活性檢測、誘導植物抗病性分析結果表明，工程菌能夠誘導煙草葉片產生過敏反應，并能提高番茄對早疫病菌的抗性[11]。喬俊卿等將harpin編碼基因導入解淀粉芽孢桿菌FZB42菌株中，harpin蛋白可分泌到胞外并保持生物活性，表現出比出發菌株更好的促生和防病能力[12]。本研究將2種harpin編碼基因導入短短芽孢桿菌HAB-5菌株中，反而降低了該菌株的抑菌能力，但能夠誘導煙草葉片產生過敏反應，并提高出發菌株的促生能力。

關于芽孢桿菌生防菌株的構建，枯草芽孢桿菌的研究較為成熟，但由于其胞外蛋白酶活性很強，會大量降解外源蛋白，在構建工程生防菌株時具有較大局限性。蘇云金芽孢桿菌雖然胞外蛋白酶活性不高，但野生菌株中含有大量內生質粒，而內生質粒對外源基因的導入和表達具有較大影響。本研究中短短芽孢桿菌HAB-5菌株的胞外蛋白酶活性僅為枯草芽孢桿菌的1.6%，且細胞壁較薄，內生質粒較少[24]，從而能有效防止外源蛋白的降解，促進外源基因的高效導入，使有促生防病效果的harpin蛋白與生防芽孢桿菌真正結合起來，研制出新型高效的生防制劑。以短短芽孢桿菌作為表達系統是研究熱點，但未見其表達harpin的相關報道。本研究結果表明，將突變體菌體總蛋白B3xm、B5xoo注射至煙草葉片，均能在煙草葉片上產生明顯的過敏性壞死斑；經SDS-PAGE電泳，分別在分子量大小為39、41 ku處可見明顯條帶，表明融合蛋白GST-harpinXm、GST-harpinXoo在突變體菌體內得到良好表達。此結論與編碼harpin基因轉入枯草芽孢桿菌[11]、解淀粉芽孢桿菌FZB42菌株的研究結論[12]相一致。

本研究通過化學方法成功將hpa1Xoo、hpaXm基因轉入短短芽孢桿菌HAB-5菌株中，得到一系列轉化子。雖轉化效率很高，但得到的突變體菌落均發生了形態變化，且目前篩選出的突變體對致病菌的拮抗效果與原始菌株相比均不理想。已有研究表明，用質粒進行菌株標記時，由于質粒中報告基因、抗生素等基因的表達是在宿主菌體的復制、轉錄、翻譯系統作用下進行的，消耗了宿主的物質和能量，對宿主造成代謝負擔，可能影響宿主菌體的拮抗性能[25]。此外，在SDS-PAGE電泳過程中發現，突變體B3xm、B5xoo菌株在整個蛋白譜帶上與HAB-5菌株有很大差異，菌株體內表達的多肽和蛋白質的數量、種類均發生了變化，從而使表達的抑菌活性物質發生改變。在突變體與病原菌C7-2菌株的對峙培養過程中，培養3 d后突變體對C7-2菌株表現出一定程度的抑菌作用，5 d后抑菌作用有所增強，7 d后抑菌作用逐漸減弱。已有研究表明，枯草芽孢桿菌代謝過程中產生的某些抗菌物質，可能作為營養物質被細菌本身和其他菌利用，導致抗菌物質減少、抑菌作用減弱[26-27]，此現象有待進一步驗證。

在番茄種子促生試驗中，與HAB-5菌株相比，突變體的促生作用明顯提高，且轉入hpaXm基因效果更佳，胚芽、胚根生長分別提高100.77%、69.14%，為今后微生物農藥的開發提供依據。10億CFU/mL HAB-5菌懸液對番茄種子的生長具有抑制作用，但隨著濃度的降低，均能對番茄種子產生促生作用。宋永燕等在研究LM-3對水稻的促生作用時發現，低濃度拮抗菌無細胞濾液對植物均有促生作用，較高濃度的拮抗菌濾液則出現抑制作用[28]，這與本研究結論相似。在番茄種子促生試驗中，未發現B3xm、B5xoo突變體菌株菌懸液抑制種子生長的現象，這可能與harpin蛋白在HAB-5菌株中的表達有關，有待開展后續相關研究，以期為生防菌的實際應用提供依據。

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