枯草芽孢桿菌21代謝物對大豆茄鐮孢菌的抑菌機制

林志偉　肖亞靜　郭春蘭等

摘要：采用顯微觀察與電導率測定相結合的方法，研究枯草芽孢桿菌21代謝物對大豆茄鐮孢菌的抑菌作用與抑制機理。結果表明：該菌株的無菌代謝物對茄鐮孢菌菌絲生長及孢子萌發均有抑制作用，當發酵液的體積分數達到90%時，對病菌孢子萌發的抑制率可達99%；顯微觀察可發現孢子畸形、頂端囊泡出現、芽管伸長受抑等現象；經無菌發酵液處理后，菌片的電導率改變，顯示出膜透性的改變。

關鍵詞：枯草芽孢桿菌；代謝物；茄鐮孢菌；抑菌

中圖分類號： S435.651文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2015）11-0175-03

收稿日期：2015-03-26

基金項目：黑龍江省教育廳產業化培育項目 （編號：1254CGZH32）。

作者簡介：林志偉（1970—），男，黑龍江勃利人，碩士，副教授，主要從事植物病蟲害綜合防治技術研究。E-mail：408160466@qq.com。大豆根腐病是黑龍江省東北部大豆產區發生較嚴重的根部病害之一，該病害發生時可影響大豆的產量和品質，一般年份減產可達10%～30%，嚴重時減產可達60%。引起大豆根腐病的病原菌有十多種，屬于鐮孢菌屬、絲核菌屬、腐霉屬和疫霉屬等，其中鐮刀菌、絲核菌的致病力較強，引起根腐病普遍發生[1-3]。

在根腐病的防治中以化學農藥拌種為主，鑒于化學農藥的生態效應，生物防治不失為一種有效的防治手段，目前已報道有多種生防制劑對該病具有防治效果[4-12]。前期的研究證明枯草芽孢桿菌21 具有生物防治能力，為了更好地開發該菌株在生產中的應用，本研究利用其代謝物對大豆根腐病菌茄鐮孢菌進行抑菌研究。

1材料與方法

1.1材料

枯草芽孢桿菌21（Bacillus subtilis 21）、大豆根腐病菌茄鐮孢菌（Fusarium solani）均保存于黑龍江八一農墾大學微生物與發酵實驗室。

大豆品種為綏農29，由黑龍江八一農墾大學大豆栽培組惠贈。

1.2試驗方法

1.2.1枯草芽孢桿菌發酵液的獲得將篩選出的枯草芽孢桿菌菌株轉接到配制好的牛肉膏蛋白胨斜面試管中，28 ℃活化20 h后，用接種環刮取1環菌體，接種于牛肉膏蛋白胨液體培養基中，在28 ℃、160 r/min振蕩培養20 h左右。當菌體D620 nm達到0.7左右時，按照3%接種量接菌到滅過菌的牛肉膏蛋白胨液體培養基中，在28 ℃、160 r/min振蕩培養36 h，即為發酵好的枯草芽孢桿菌。發酵后的培養液先經離心沉淀，然后去除菌體，在無菌條件下吸取發酵上清液，用孔徑大小為0.22 μm的微孔濾膜進行過濾除菌，獲得拮抗無菌濾液。

1.2.2代謝物對茄鐮孢菌菌絲生長的抑制以茄鐮孢菌為指示菌，將病原真菌活化，待其長滿平板后，用直徑為5 mm的打孔器打成大小一致的菌碟，用接種針挑取菌碟分別接入PDA平板中，28 ℃恒溫培養1 d后，在距離菌碟3 cm處插入已滅菌的牛津杯，并向牛津杯內注入相同體積的處理好的無菌濾液，每組重復3次，置于28 ℃恒溫箱中培養4 d后測量抑菌圈半徑。

1.2.3不同濃度發酵液對植物病原菌孢子萌發的影響分別向含有0.1 mL的5.2×107個/mL的茄鐮孢菌分生孢子懸浮液中加入0.9、0.8、0.7、0.6、0.5 mL枯草芽孢桿菌發酵液，并用無菌水定容使其最終體系均為1 mL，即發酵液的體積分數分別為90%、80%、70%、60%、50%；以未加發酵液的茄鐮孢菌分生孢子懸浮液作為空白對照，充分混勻后于28 ℃恒溫暗培養，當空白對照的孢子萌發率達到90%以上時，調查各處理孢子萌發情況，每個載玻片觀察10個視野，共計300個孢子，孢子萌發形成的芽管長度大于孢子一半時視為萌發，計算不同濃度枯草芽孢桿菌發酵液處理的孢子萌發率，對發酵液作用下孢子萌發出現的畸形情況拍照記錄，相關計算公式如下：

孢子萌發率=（萌發的孢子/300）×100%；

抑制百分率=（空白對照孢子萌發率-處理孢子萌發率）/空白對照孢子萌發率×100%。

1.2.4無菌發酵液處理對茄鐮孢菌電導率變化的影響用直徑為5 mm的打孔器在已活化好的鐮刀菌菌落同心環處打取菌碟，分別培養在直徑為9 cm的含有20 mL查氏培養基的培養皿中，28 ℃恒溫暗培養4 d，待用。將培養好的鐮刀菌菌片用重蒸水沖洗5遍，真空抽濾吸干水分后，放入裝有無菌發酵液的100 mL三角瓶中浸漬，保證菌片完全浸沒在培養液中，每2 h取5個菌片，用重蒸水沖洗5次，保證菌片完好。將沖洗后的菌片放入有盛有35 mL無離子水的50 mL三角瓶中，即刻利用電導率儀測定電導率，之后靜置30 min，再次測定浸漬液的電導率，兩者差值可以反映出所測菌體在處理時間內的細胞內容物滲出程度。以浸于清水中的菌片的電導率為對照。

2結果與分析

2.1代謝物對茄鐮孢菌菌絲生長的抑制

試驗中證實：經對峙培養后，枯草芽孢桿菌21對茄鐮刀菌的菌絲生長可以產生抑菌圈（圖1-a），抑菌圈直徑可達0.9 cm，因而進一步進行了該菌株代謝物的抑菌作用研究。測定結果表明：采用管碟法獲得的抑菌圈直徑可達0.7 cm（圖1-b），菌絲生長抑制率為83.4%。

2.2代謝物對茄鐮孢菌孢子萌發的影響

枯草芽孢桿菌產生的代謝產物主要為抗菌肽類及一些蛋白類拮抗物，對病原菌的孢子萌發及菌絲生長產生抑制作用。利用無菌代謝物處理病原菌孢子，通過定時觀察顯微鏡下孢子萌發情況發現：28 ℃黑暗恒溫培養8 h后，對照（清水處理）中茄鐮孢菌孢子萌發率可達到95%以上；而不同濃度代謝物處理茄鐮孢菌的分生孢子后，對鐮孢菌的孢子萌發均產生抑制作用，但不同濃度抑制程度不同，且隨著發酵液濃度的增加，孢子萌發率逐漸降低，即發酵液體積分數分別為50%、60%、70%、80%、90%時，鐮孢菌的孢子萌發率分別為67.0%、18.0%、7.0%、3.0%、0.7%，即當發酵液的體積分數達到90%時，對病菌孢子萌發的抑制率可達99%（表1）；供試不同濃度的發酵液對孢子萌發都有強烈抑制作用，在顯微鏡下均可觀察到大量的畸變孢子及不萌發的孢子，畸變形態多樣，部分孢子頂端出現囊泡，部分孢子頂端膨大變形，部分孢子萌發長出了芽管，但芽管無法進一步伸長（圖2-a）；而對照組孢子可正常萌芽并形成大量光滑修長的菌絲體（圖2-b）。

2.3枯草芽孢桿菌無菌代謝物處理茄鐮孢菌后菌體電導率的變化

電導率的變化可以衡量溶液中離子強度的大小，也在一定程度上反映細胞膜透性的改變。通過對浸泡不同時間鐮刀菌菌片電導率的測定發現：與對照相比，經無菌發酵液處理過的菌體浸漬液電導率變化趨勢與對照（水）處理的電導率變化不同，發酵液處理2～16 h內的菌片浸漬液電導率均高于清水處理，且以處理10 h時電導率值最高，高出對照186%，隨后呈下降趨勢；當發酵液處理18～28 h時，菌體浸漬液電導率值卻明顯低于對照，尤其是發酵液處理20～28 h時，電導率值相對平穩（圖3）。從結果中可看出，隨著發酵液對菌體處理時間的延長，菌體的內容物外滲作用增加，當作用16 h后，菌體內容物幾乎全部外滲；而在18 h后，發酵液處理的菌片電導率反而低于對照，這可能與清水處理菌片損傷程度較小有關，從清水對照處理不同時間電導率值變化較平穩也能體現這一點。

3結論與討論

拮抗微生物在植物病害防治方面機理復雜，主要體現在空間和營養競爭、產生抗菌物質與誘導植物抗病性等方面。

已有大量文獻報道了不同拮抗微生物的拮抗效果，其中拮抗細菌主要為芽孢桿菌，且主要的菌種為枯草芽孢桿菌（B. subtilis）、蠟樣芽孢桿菌（B. cereus），多黏芽孢桿菌（B. polymyxa）、地衣芽孢桿菌（B. lincheniformis）、短小芽孢桿菌（B. pumilus）等，不同菌株對不同植物病原真菌表現出不同的抑制效果[4-7，13-22] 。試驗選用的枯草芽孢桿菌21菌株對茄鐮孢菌的菌絲生長表現出明顯抑制作用，可作為潛在的生防菌株進一步開發與應用。

微生物的代謝產物種類多樣，是有效的殺菌成分，代謝物抑菌機理的探討也是目前生物防治研究的熱點之一。利用顯微觀察法研究真菌、細菌或放線菌代謝物的抑菌效果時，均觀察到了病原菌菌絲生長畸形或孢子萌發畸形的現象[21]。在對枯草芽孢桿菌21菌株無菌濾液抑菌研究中，也同樣觀察到了病原菌孢子畸形、無法正常萌發的現象，這一結果的獲得為該菌株的開發應用提供有力支持。

真菌的細胞壁與細胞膜是調節物質運輸的重要細胞器，一旦細胞壁與膜受到損傷后會有電解質的滲漏，因而測定電解率的變化可以作為判斷膜損傷的依據之一。許多研究表明，作用于細胞膜的抗菌物都能促使電導率的增高[18，21]。本研究經處理后的病原菌菌體浸液的電導率也出現增高的現象，且與對照相比電導率增高在處理2 h后即有明顯的表現，表明該菌株在真菌病害防治中具有重要潛力。

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