兔出血癥病毒桿狀病毒載體滅活疫苗安全性及效力試驗

范志宇　魏后軍　胡波等

摘要：本研究旨在對實驗室制備的兔出血癥病毒桿狀病毒載體滅活疫苗的安全性和效力進行全面系統的研究。實驗室制備了5批次兔出血癥病毒桿狀病毒載體滅活疫苗，按照現行《中國獸藥典》附錄對疫苗進行了性狀、無菌檢驗、甲醛殘留量、安全及效力試驗。結果顯示，5批次疫苗無菌檢驗、甲醛殘留量均合格；疫苗對肉兔、獺兔、毛兔3個品種家兔均安全，接種疫苗后30、60 d，剖檢注射部位未見炎癥反應，疫苗吸收良好，并且疫苗對懷孕母兔、未斷奶仔兔、斷奶幼兔也安全；對肉兔各項生產性能也沒有影響，說明該疫苗具有較好的安全性。疫苗免疫21 d后，易感家兔和母兔均能抵抗兔出血癥強毒攻擊，說明該疫苗免疫原性良好。

關鍵詞：兔出血癥病毒桿狀病毒；滅活疫苗；安全性試驗；效力試驗

中圖分類號： S852.65；S858.291.53文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2015）11-0272-03

收稿日期：2015-07-02

基金資助：現代農業產業技術體系建設兔體系病毒病預防與控制崗位（編號：CARS-44-C-1）；公益性行業（農業）科研專項（編號：201303046）；江蘇省農業科技自主創新資金[編號：CX（14）4048]。

作者簡介：范志宇（1982—），男，山西太谷人，博士，助理研究員，主要從事家兔疾病防治與獸醫生物技術研究。Tel：（025）84390337；E-mail：fanzhiyu2007@163.com。

通信作者：王芳，博士，研究員，主要從事家兔重要疫病的病原學、快速診斷、流行病學、致病機理、疫苗研制、綜合防控技術等方面的研究。Tel：（025）84390337；E-mail：rwangfang@126.com。兔出血癥，又稱兔瘟，是由兔出血癥病毒（rabbit haemorrhagic disease virus，RHDV）引起的一種以急性、高度傳染性、大面積死亡為特征的兔傳染病，主要臨床特征為呼吸系統出血、肝變性、實質器官瘀血及出血性變化[1-3]。本病常呈暴發性流行，發病率和病死率極高，感染兔通常于48～72 h死亡，給養兔業造成極大的經濟損失。該病自然感染只發生于兔，主要危害40日齡以上幼兔、育成兔和成年兔，40日齡以下幼兔和部分老齡兔不易感，哺乳仔兔不發病[2-4]。帶毒兔及病死兔的內臟器官、肌肉、毛、血液、分泌物、排泄物是主要的傳染源，帶毒兔和被病毒污染的飼料、飲水、用具也是重要的傳染源或傳播媒介。目前該病的主要預防措施是使用組織滅活疫苗免疫，然而傳統組織滅活苗的制備存在諸多的缺陷和不足，因此，需要探索新的生產疫苗的途徑[5-6]。

RHDV是杯狀病毒科成員，結構簡單，僅有1個主要結構蛋白VP60，在誘導抗病毒感染的免疫反應中起重要作用，是病毒免疫保護性抗原，用桿狀病毒系統表達RHDV的VP60能夠自發地組裝成病毒樣粒子（VLPs），其在形態和抗原性上都與天然的病毒粒子無異但不包含病毒RNA基因組。研究發現RHDV VLPs在兔體內可以誘導機體產生很強的體液免疫應答、細胞免疫應答和黏膜免疫應答。此外，RHDV VLPs具有成本低、獲取方便等優勢，已經成為應用性預防治療中可靠的分子工具[3-7]。在前期研究的基礎上，于實驗室用RHDV重組VP60制備了5批次疫苗，并對疫苗開展了系統的研究。

1材料與方法

1.1種毒

重組兔出血癥病毒VP60桿狀病毒，由江蘇省農業科學院獸醫研究所構建并保存[5]。攻毒用毒種為兔出血癥病毒皖阜株肝毒。Sf9昆蟲細胞，由江蘇省農業科學院獸醫研究所保存。

1.2試驗兔

2～3月齡健康易感肉兔、獺兔、毛兔（兔出血癥病毒抗體HI效價不高于1 ∶2），健康懷孕20～25 d母兔，20～30日齡未斷奶仔兔、35日齡已斷奶幼兔（未免疫兔出血癥及相關疫苗），均由金陵種兔場提供。

1.3試劑

Sf-900TMⅡSFM 培養基，購自GIBCO公司。硫乙醇酸鹽培養基（TG）、酪胨瓊脂（GA）、葡萄糖蛋白胨培養基（GP）、氫氧化鋁膠溶液由南京天邦生物科技有限公司制備并檢驗。

1.4抗原制備及紅細胞凝集效價的測定

將重組兔出血癥病毒VP60桿狀病毒接種Sf9昆蟲細胞，于27～28 ℃培養，連續觀察，待細胞病變達85%以上時，收獲細胞培養物。將收獲接種種毒的細胞培養物反復凍融3次，取50 μL于50孔板，用PBS作2倍比稀釋，加入等體積1%人O型紅細胞懸液，振蕩均勻，置于2～8 ℃作用45 min，觀察結果，檢測表達蛋白的HA效價[8-9]。

1.5滅活及滅活檢驗[9]

向細胞培養物中加入甲醛溶液（終濃度為0.2%），37 ℃滅活24 h。取滅活細胞培養物，接種生長良好的Sf9細胞，于27～28 ℃條件下培養，同時設立未滅活的細胞培養物為陽性對照，按上述方法接種Sf9細胞，連續5 d觀察細胞病變，收獲細胞培養物，置-20 ℃以下反復凍融3次，接種生長良好的Sf9細胞盲傳1代，培養5 d，觀察細胞病變，并測定其血凝性。

1.6疫苗制備

將檢驗合格的細胞培養物和氫氧化鋁膠按9 ∶1充分混勻振蕩，定量分裝，加蓋密封，貼簽。

1.7成品檢驗

1.7.1性狀取疫苗瓶上下顛倒混勻，觀察外觀及顏色，然后將疫苗瓶于2～8 ℃靜置24 h，再次觀察外觀及顏色。

1.7.2無菌檢驗按2010版《中國獸藥典》附錄進行檢驗。

1.7.3甲醛殘留量測定按2010版《中國獸藥典》附錄進行檢驗。

1.8安全試驗[10]

1.8.1單劑量安全試驗

1.8.1.1單劑量安全試驗實驗室制備的5批次疫苗（批號：101、102、103、104、105）各用2～3月齡健康易感家兔5只，分別皮下注射1 mL/只，同時以相同條件家兔作為對照，不接種疫苗，觀察家兔精神狀態、飲食、糞便、局部及全身反應等，連續觀察14 d。

1.8.1.2單劑量重復安全試驗5批次疫苗各用2～3月齡健康易感家兔5只，分別皮下注射1 mL/只，14 d后，重復皮下注射相同劑量的滅活疫苗，以相同條件家兔作為對照，不接種疫苗，觀察家兔精神狀態、飲食、糞便、局部及全身反應等，連續觀察14 d。

1.8.2超劑量安全試驗

1.8.2.1不同品種家兔安全試驗實驗室制備的5批次疫苗各用2～3月齡健康易感肉兔、獺兔、毛兔各5只，分別皮下注射2 mL/只，同時以相同條件家兔作為對照，不接種疫苗，觀察家兔精神狀態、飲食、糞便、局部及全身反應等，連續觀察60 d，并于30 d每組取2只、60 d每組取3只安樂死后進行剖檢，觀察疫苗注射部位局部組織疫苗吸收和炎癥反應情況。

1.8.2.2懷孕母兔安全試驗5批次疫苗各用懷孕20～25 d 母兔5只，分別皮下注射2 mL/只，以相同條件不接種疫苗家兔作為對照，觀察精神狀態、飲食、糞便、局部及全身反應等，并觀察懷孕母兔妊娠、分娩及胎兒健康狀況，觀察期14 d。

1.8.2.3其他日齡家兔安全試驗5批次疫苗各用35日齡斷奶未免疫兔出血癥疫苗的幼兔5只，并各用20～30日齡未斷奶未免疫兔出血癥疫苗的仔兔5只進行安全試驗，處理方法同“1.8.2.2”節。

1.8.2.4對肉兔生產性能的影響5批次疫苗各用35～40日齡的健康肉兔5只，分別皮下注射2 mL/只，以相同條件家兔作為對照，不接種疫苗，每日10：00測量并記錄 14 d 內家兔的體溫，觀察45 d內家兔生長發育情況，記錄注射疫苗時和觀察期結束時家兔的體質量，觀察期內飼料消耗的重量，觀察期結束時出欄家兔數量，并計算家兔增重、飼料報酬（料肉比）、出欄率等。

1.9效力試驗

1.9.1易感家兔效力試驗實驗室制備的5批次疫苗各用2～3月齡健康易感家兔5只，分別皮下注射1 mL/只，21 d后，連同相同條件對照兔5只，各皮下注射兔出血癥病毒皖阜株肝毒1 mL，連續觀察7 d，記錄死亡與保護的動物數量，對死亡兔剖檢觀察并取肝臟進行人“O”型紅細胞凝集試驗。

1.9.2懷孕母兔效力試驗實驗室制備的5批次疫苗各用健康懷孕母兔5只，處理方法同“1.9.1”節。

2結果與分析

2.1抗原紅細胞凝集效價

經測定，5批次細胞培養物紅細胞凝集效價在1 ∶512～1 ∶1 024 之間，分別為1 ∶1 024、1 ∶512、1 ∶512、1 ∶1 024、1 ∶512。

2.2滅活檢驗

用甲醛溶液對細胞培養物進行滅活，結果顯示，接種滅活細胞培養物的Sf9昆蟲細胞及正常Sf9昆蟲細胞生長狀況良好，細胞分裂正常。收獲接毒細胞培養物，于-20 ℃以下反復凍融3次，取適量再次接種生長良好的Sf9細胞，于27～28 ℃ 培養5 d，結果顯示，接種滅活細胞培養物的Sf9昆蟲細胞及正常Sf9昆蟲細胞生長狀況良好，細胞分裂正常；而加入未滅活細胞培養物的細胞病變明顯，細胞培養物具有血凝性。說明接毒細胞培養物滅活完全。

2.3疫苗配制

按“1.6”節的方法制備試驗用疫苗5批次，約4 000 mL/批次，批號為101、102、103、104、105。

2.4性狀、無菌檢驗、甲醛殘留量測定

對5批次疫苗進行性狀、無菌檢驗、甲醛殘留量測定，結果顯示，5批次疫苗（101、102、103、104、105）外觀為淺黃色均勻混懸液，靜置后上層為淺黃色的澄清液體，下層有少量沉淀。TG小管、GA斜面在37 ℃培養7 d，TG小管、GA斜面、GP小管在25 ℃培養7 d均無菌生長，無菌檢驗合格。經檢驗，疫苗甲醛殘留量在0.042%～0.087%之間，符合質量標準。

2.5安全試驗

2.5.1單劑量安全試驗用5批次疫苗對家兔進行單劑量安全試驗，連續觀察14 d，結果顯示，免疫兔和對照兔的精神狀態、飲食、糞便等均正常，免疫兔未見疫苗接種引起的異常臨床癥狀，說明疫苗對2～3月齡健康易感家兔單劑量接種及單劑量重復接種均是安全的。

2.5.2超劑量安全試驗

2.5.2.1不同品種家兔安全試驗用5批次疫苗進行不同品種家兔安全試驗，結果顯示，觀察期60 d，2～3月齡肉兔、獺兔、毛兔3個品種家兔的精神狀態、飲食、糞便等均正常；免疫兔未見疫苗接種引起的異常臨床癥狀，疫苗接種后30 d及60 d，剖檢注射部位未見炎癥反應，疫苗吸收良好，說明疫苗對不同品種的家兔是安全的。

2.5.2.2懷孕母兔安全試驗用5批次疫苗進行懷孕母兔安全試驗，結果顯示，觀察期14 d，免疫兔和對照兔的精神狀態、飲食、糞便等均正常；免疫兔未見疫苗接種引起的異常臨床癥狀，母兔均正常妊娠、分娩，免疫兔和對照兔生產的仔兔數量沒有差異，胎兒健康，未見異常，說明疫苗對懷孕母兔是安全的。

2.5.2.3其他日齡家兔安全試驗用5批次疫苗對其他日齡家兔進行安全試驗，結果顯示，觀察期14 d，未斷奶仔兔、已斷奶幼兔的免疫兔和對照兔精神狀態、飲食、糞便等均正常，仔兔正常斷奶，并且生長良好；免疫兔未見疫苗接種引起的異常臨床癥狀，說明該疫苗對未斷奶仔兔和已斷奶幼兔均是安全的。

2.5.2.4對肉兔生產性能的影響用5批次疫苗進行肉兔生產性能影響試驗，結果顯示，觀察期14 d，免疫兔和對照兔體溫處于38.5～39.5 ℃的正常范圍內，免疫兔與對照兔相比較，體溫沒有明顯差異（圖1）。觀察期45 d，免疫兔和對照兔生長發育均良好，免疫組各5只家兔共增加體質量分別為6 207、6 367、6 314、5 960、6 068 g，對照組5只家兔共增加體質量6 108 g，由此計算飼料報酬（料肉比），免疫組與對照組相比較，差異不顯著（P>0.05）；出欄率均為100%（表1）。結果說明該疫苗對肉兔生產性能沒有影響。

2.6效力試驗

用5批次疫苗進行效力試驗，結果（表2）顯示，5批疫苗免疫易感家兔全部健康存活，對照兔死亡5只，死亡兔出現兔出血癥典型的病理變化，對死亡兔肝臟懸液作人“O”型紅細胞凝集試驗，均為RHDV陽性。另一組攻毒結果顯示，5批疫苗免疫母兔全部健康存活，對照兔死亡4只，死亡兔出現兔出血癥典型的病理變化，對死亡兔肝臟懸液作人“O”型紅細胞凝集試驗，均為陽性。結果說明該疫苗可以對母兔和易感家兔提供完全保護。

3討論

目前，由于兔出血癥病毒不能在兔體以外的組織或細胞上增殖，因此，只能通過用強毒接種易感兔，收獲含毒組織制成乳劑，用甲醛滅活后制成疫苗[6，11]。這種生產方式主要存在以下缺陷和不足：易感兔來源少、生產成本高、污染物安全處理困難且易造成散毒、動物福利難以保障等。利用基因工程技術開發新疫苗是解決當前傳統疫苗問題的有效途徑，國內外已經用大腸桿菌、酵母、昆蟲細胞等多種表達系統對RHDV的免疫蛋白VP60進行了表達，并且多數表達系統都表現出良好的免疫原性[3，12]。桿狀病毒系統表達的RHDV重組衣殼蛋白能夠很好地自聚形成能夠凝集人“O”型紅細胞的病毒樣顆粒（VLPs），由于VLPs結構與成熟病毒相似，但不含病毒核酸，不具有感染性，所以在體內這種空殼結構VLPs不會引發感染，因此作為疫苗非常安全[13]。而且VLPs能夠在很低劑量的抗體情況下引發有效的保護性反應，這將大大降低疫苗的成本，同時該表達系統具有低成本、高表達和易于規模生產等特點[14，15]。

本研究在完成重組兔出血癥病毒VP60桿狀病毒毒種的構建及特性研究的基礎上，實驗室試制了5批次疫苗（批號101、102、103、104、105），共計約20 000 mL。按照現行《中國獸藥典》附錄對5批次疫苗進行性狀、無菌、甲醛殘留量檢驗及安全、效力試驗，結果顯示，5批次疫苗無菌檢驗、甲醛殘留量均合格。安全性結果表明，該疫苗可以用于懷孕母兔，優于目前市售組織滅活疫苗，并且對20～30日齡未斷奶仔兔、35日齡已斷奶幼兔都非常安全，對肉兔的各項生產性能也沒有影響。本研究的安全性試驗是使用5批次疫苗免疫3個品種家兔的多次試驗完成的，試驗結果說明該疫苗對各個年齡段的家兔均是安全的。疫苗免疫21 d后2～3月齡家兔和母兔用致死劑量的兔出血癥病毒攻擊保護率都達100%，說明該疫苗免疫原性良好。該疫苗具有較高的安全性和良好的免疫原性，市場前景樂觀。

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