飼用L—色氨酸添加劑的Ames試驗

趙莎莎　周澤偉　鄭玲敏等

摘要：通過對飼用L-色氨酸進行鼠傷寒沙門氏菌回復突變試驗（Ames試驗），評價該飼料添加劑的潛在致突變性。飼用L-色氨酸在0.008～5.000 mg/皿的范圍內分為5個劑量組，在加（+）S9、不加（-）S9的情況下，以TA97、TA98、TA100、TA102為試驗菌株進行Ames試驗。以敵克松等作為陽性對照，滅菌水為空白對照，二甲基亞砜為溶劑對照，采用雙盲法計算回復突變菌落數。結果表明，陽性對照試驗各菌株反應合格；飼用L-色氨酸無論在加（+）S9、不加（-）S9的情況下，4株試驗菌的平均回變菌落數均小于陰性（溶劑）對照組的2倍，未見劑量-反應關系，且2次試驗結果一致。飼用L-色氨酸的Ames試驗結果為陰性，表明該飼料添加劑無體外致突變性。

關鍵詞：L-色氨酸；Ames試驗；飼料添加劑

中圖分類號：S816.71文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2015）11-0287-02

收稿日期：2015-03-23

基金項目：江蘇高校優勢學科建設工程項目；揚州大學新世紀人才工程。

作者簡介：趙莎莎（1979—），女，江蘇徐州人，講師，主要從事實驗室教學工作。E-mail：157568300@qq.com。

通信作者：張雨梅，博士，教授。E-mail：zym@yzu.edu.cn。L-色氨酸是人和動物的必需氨基酸之一，參與機體蛋白質合成和營養代謝調節。色氨酸在體內合成極少，須從外界攝取滿足機體需要。國內外在食品中已廣泛將L-色氨酸作為食品添加劑，以強化對蛋白質的利用率，對于強化食品提高植物蛋白的利用率具有重要作用[1]。

L-色氨酸是繼賴氨酸、蛋氨酸之后的又一個重要的飼料添加氨基酸。色氨酸的代謝產物5-羥基色氨酸在動物體內有抗高密度、斷奶等應激作用，還能促進γ-球蛋白的產生、增強機體抗病能力[2-3]。在低蛋白飼料中添加色氨酸對改善飼料效率、提高畜禽增重和家禽生產性能[4-6]、增強免疫機能十分有效[7-10]。Li等在飼料中添加0.04% L-色氨酸可顯著提高蛋雛鴨平均日增質量、飼料轉化率[6]。周斌等研究發現，在含0.06% L-色氨酸的日糧中額外添加0.03%、 0.06% 、0.09% L-色氨酸，可顯著提高0～3周齡肉仔雞平均日增質量[7]。L-色氨酸有促進骨髓T 淋巴細胞前體分化為成熟T 淋巴細胞，具有免疫增強作用[11-12]，L-色氨酸缺乏則會導致體液免疫功能降低[13]。雞飼料中添加L-色氨酸可顯著提高α干擾素、γ干擾素和IgG水平，同時在傳染性法氏囊病免疫方面作用顯著。

在蛋雛鴨飼料中添加0.04% L-色氨酸可顯著提高蛋雛鴨脾臟指數，添加 0.06% L-色氨酸可顯著提高蛋雛鴨胸腺指數。由于L-色氨酸生產工藝不斷改進、生產成本逐漸降低，其作為飼料添加劑在畜禽生產中的應用越來越廣泛。本研究通過鼠傷寒沙門氏菌回復突變試驗（Ames試驗）評價某企業新的生產工藝生產的飼用L-色氨酸的致突變性。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1受試物及溶液配制飼用20%L-色氨酸，批號20130409，黃色顆粒，由浙江某生物股份有限公司提供。

飼用L-色氨酸充分研磨后，稱取5.00 g溶于100 mL滅菌蒸餾水中。用直徑50 mm 的無菌濾膜（孔徑0.22 μm）過濾除菌，用滅菌蒸餾水梯度稀釋至所需濃度，現配現用。

陽性對照物：2-氨基芴（2-AF），純度>99%，日本東京化成工業株式會社；敵克松，純度98.8%，美國DIMA技術有限公司；4-硝基喹啉-N-氧化物、甲基磺酸甲酯，純度均大于98%，美國Amresco公司；多氯聯苯（Aroclor1254），美國Crescent Chemical 有限公司。陽性對照物均用二甲基亞砜作為溶劑配制成相關濃度。

1.1.2試驗菌株TA97、TA98、TA100、TA102菌株由江蘇省疾病控制中心提供，-80 ℃保存。試驗菌株生物學特性按GB 15193.4—2003《鼠傷寒沙門氏菌/哺乳動物微粒體酶試驗》標準方法鑒定，符合試驗要求。

1.2試驗方法

1.2.1大鼠肝微粒體酶的誘導和S9的制備雄性成年Wistar大鼠2只，多氯聯苯（Aroclor1254）溶于玉米油中制成200 mg/mL溶液，按500 mg/kg腹腔注射作為誘導劑。按GB 15193.4—2003《鼠傷寒沙門氏菌/哺乳動物微粒體酶試驗》方法制備S9，生物活性鑒定合格后，-80 ℃保存備用。

1.2.2平板摻入法Ames試驗根據預試驗結果，受試物飼用L-色氨酸的劑量設置分別為5.00、1.00、0.20、0.04、 8.0 0 μg/皿 ；另設陰性（溶劑）對照組和陽性對照組，每個試驗組分加（+）S9、不加（-）S9等2個系列，每個系列設3個平行平皿。陽性對照組：加S9 時，4株菌株均用2-氨基芴（2-AF），濃度為100 μg/mL[0.1 μg/（μL·皿）]；不加S9時，TA97、TA98用敵克松，濃度為0.5 mg/mL[0.5 μg/（μL·皿）] ，TA100用4-硝基喹啉-N-氧化物，濃度為5 μg/mL[0.005 μg/（μL·皿）]，TA102用甲基磺酸甲酯，濃度為 10 μg/mL[0.01 μg/（μL·皿）]。

雙盲法記錄每皿回變菌落數。按GB 15193.4—2003《鼠傷寒沙門氏菌/哺乳動物微粒體酶試驗》的標準判定Ames試驗結果為陰性或陽性。

1.2.3觀察指標整個試驗過程中需觀察試驗菌是否正常生長，陰性對照組每皿自發回變菌落數是否在正常范圍，陽性對照試驗各菌株反應是否合格。

雙盲法記錄受試物各劑量組、陽性對照組、溶劑對照組和空白對照（自發回變）的每皿回變菌落數。

1.2.4結果判定如果受試物的回變菌落數是溶劑對照組回變菌落數的2倍或2倍以上、受試品的回復突變數的增加與劑量相關并有統計學意義、某一劑量組呈現可重復的回復突變數增加并有統計學意義，則判為誘變陽性（有致突變作用），反之為陰性。

2結果與分析

4種試驗用鼠傷寒沙門氏菌株菌苔生長正常，陽性對照試驗各菌株反應合格。2次重復試驗結果見表1、表2。

3結論與討論

在本研究中，飼用L-色氨酸飼料添加劑的鼠傷寒沙門氏菌突變試驗結果為陰性，表明飼用L-色氨酸飼料添加劑對鼠傷寒沙門氏菌試驗株無致突變性。

Ames試驗是遺傳毒理學的一種體外試驗，遺傳學終點是基因突變，用于檢測受試物能否引起鼠傷寒沙門氏菌基因組堿基置換或移碼突變。如果對飼用L-色氨酸進一步進行小鼠微核試驗、精子畸形試驗、染色體畸變試驗、姊妹染色體交換試驗或顯性致死試驗，則可以更全面地評價其致突變作用。

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