不同程度隱性乳房炎奶牛乳清中結合珠蛋白的變化

尹柏雙　王秋竹++付連軍等

摘要：為研究奶牛隱性乳房炎發病程度與乳清中結合珠蛋白（HP）含量變化的關系，選取6頭健康奶牛和18頭患輕、中、重度隱性乳房炎奶牛為試驗動物，采集乳樣、分離乳清，利用HP ELISA檢測試劑盒測定樣品中HP含量。結果發現，隨著隱性乳房炎病情加重、乳汁體細胞數的增加，乳清中HP含量逐漸升高，與健康對照組比較升高極顯著（P<0.01）。結果表明，乳清中HP含量變化與隱性乳房炎發病具有一定相關性，乳腺損傷程度和乳汁體細胞數與乳清中HP含量呈正相關。

關鍵詞：隱性乳房炎；奶牛；乳清；結合珠蛋白

中圖分類號： S858.232+.6文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2015）11-0289-02

收稿日期：2014-11-10

基金項目：吉林省科技廳重點科技攻關項目（編號：20130206040NY）；吉林省教育廳“十二五”科學技術項目（編號：吉教科合字2013339）；吉林市科技局杰出青年培育專項（編號：2013625019）；吉林農業科技學院重點學科培育項目（編號：吉農科合字2013X021）。

作者簡介：尹柏雙（1978—），男，黑龍江哈爾濱人，博士，副教授，從事奶牛乳腺疾病方向的研究工作。E-mail：ybs3421@126.com。奶牛乳房炎是危害奶牛養殖業最嚴重的疾病之一，其中隱性乳房炎發生率最高。隱性乳房炎可引起泌乳奶牛產奶量下降、牛奶品質降低、養殖成本增加、產后發情延長、妊娠時間推遲，給奶牛養殖業帶來巨大經濟損失[1]。結合珠蛋白（HP）是血清α2球蛋白組中的一種酸性糖蛋白，在哺乳動物血液和其他體液中廣泛分布，具有結合炎癥疾病標記物、游離血紅蛋白、抗菌、免疫調節等主要功能[2-6]。Grnlund等研究表明，在金黃色葡萄球菌引起奶牛乳房炎的急性期，血清結合珠蛋白的表達量增加[7]。楊永新等研究表明，臨床型乳房炎奶牛乳汁中結合珠蛋白表達量顯著增加[8]。本試驗研究乳清中結合珠蛋白表達量與不同程度奶牛隱性乳房炎發病的關系，以期為隱性乳房炎判定提供理論依據。

1材料與方法

1.1試驗動物

通過乳汁體細胞計數監測后選擇年齡、胎次、產奶量、泌乳期等指標相近的健康奶牛6頭和患不同程度奶牛隱性乳房炎奶牛18頭，由吉林市某奶牛場提供。

1.2主要試劑與儀器

結合珠蛋白（HP）含量測定用HP ELISA試劑盒，購于南京建成生物試劑研究所；主要儀器有Fossmatic 5000體細胞計數儀（FOSS公司，丹麥）、Varioskan酶標儀（Thermo公司，美國）、離心機（Sigma公司，美國）。

1.3試驗動物分組

通過乳汁體細胞計數監測后將試驗奶牛分成健康對照組[6頭，體細胞數量（SCC）<10×104 個/mL]、輕度隱性乳房炎組（6頭，50×104 個/mL500×104 個/mL）。

1.4乳樣采集

采集試驗奶牛的乳汁，采樣前對乳區進行清洗，然后用70%乙醇消毒乳區，棄掉前3 把乳汁，分別采10 mL乳裝入無菌試管中，將采集的乳樣放到冰盒中，帶回實驗室檢測。

1.5乳清制備

將采集的乳樣于3 000 r/min離心5 min，除去上層乳脂，然后于16 000 r/min高速離心機中離心10 min，去除沉淀，保留上清，4 ℃條件下保存、待測。

1.6檢測方法

乳汁體細胞計數采用體細胞計數儀測定；HP含量采用HP ELISA試劑盒測定，在酶標儀上比色測定D450 nm吸光值，根據試劑盒說明繪制標準曲線后計算HP含量。

1.7數據處理

采用SPSS 17.0數據分析系統作單因素方差分析，結果以“均值±標準差”表示，P<0.01為差異極顯著，P<0.05為差異顯著。

2結果與分析

2.1乳清中結合珠蛋白標準曲線及回歸方程

通過ELISA HP檢測試劑盒檢測5個濃度梯度的HP標樣的 D450 nm，利用ELISA Calc回歸/擬合軟件進行分析。以HP濃度為自變量X（μg/mL）、D450 nm為因變量Y，擬合直線回歸方程為：y=0.069 54x+0.144 46，r2=0.998 51，濃度與吸光度線性回歸良好，表明該方法檢測樣品值可信度較高（圖1）。

2.2乳清中結合珠蛋白檢測結果

由表1可知，患輕度乳房炎奶牛乳清中HP含量為74111 μg/mL，極顯著高于健康對照組；同樣，患中、重度乳房炎奶牛乳清中HP含量也極顯著高于健康對照組。此外，隨著乳房炎病情加重、乳汁體細胞數增加，乳清中HP含量逐漸升高，表明乳腺損傷程度和乳汁體細胞數與乳清中HP含量呈正相關。

表1奶牛乳清中C-反應蛋白含量

組別樣品數量（個）HP含量（μg/mL）健康對照組632.573±4.947輕度乳房炎組674.111±10.357**中度乳房炎組677.093±4.394**重度乳房炎組686.146±8.521**注：“**”表示與對照組比較差異極顯著（P<0.01）。

3討論

結合珠蛋白主要由肝臟合成，參與機體的免疫應答，屬急性期反應蛋白，其表達受細胞因子和前列腺素（PG）等不同因素的調節，炎癥、創傷和感染等病理狀態也會影響血液HP含量的變化[9]。Khoshvaghpi等研究患有外科感染、急性子宮炎奶牛血清和牛奶中HP變化結果表明，血清和牛奶中HP濃度均高于健康奶牛[10]。楊永新等研究結果表明，大腸桿菌性乳房炎奶牛血漿中結合珠蛋白表達量顯著高于健康奶牛[11]；試驗誘導或自然發生的大腸桿菌乳房炎奶牛血清中結合珠蛋白的濃度增加[12-13]；患輕度乳房炎奶牛血清和牛奶中HP含量均升高[14]；陳國燦等檢測自然感染隱性乳房炎奶牛乳汁中的結合珠蛋白濃度結果表明，奶牛患隱性乳房炎時，其肝臟合成的HP增加，導致乳汁中HP含量也增加[15]；Grnlund等報道，患金黃色葡萄球菌性乳房炎的奶牛，在急性期時乳汁和血清中HP含量迅速升高[7，16]。本試驗結果表明，與健康對照組相比，患隱性乳房炎奶牛乳清中HP含量極顯著升高，隨著隱性乳房炎病情加劇，乳汁中HP含量逐漸升高，這與以往研究結果基本一致。在臨床獸醫學領域針對我國奶牛隱性乳房癌高發病率和診斷技術相對落后的情況下，利用乳清中HP含量變化的特點，開展早期快速診斷將具有廣闊的研究空間和發展前景。

4結論

本研究結果表明，乳清中HP含量變化與隱性乳房炎發病具有一定相關性，隨著乳腺損傷程度和乳汁體細胞數增加，乳清中HP含量顯著升高。

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