4種蝦虎魚類精子超微結(jié)構(gòu)的研究與比較

王茜　王小剛　李鵬等

摘要：采用掃描電鏡和透射電鏡分別對(duì)云斑尖塘鱧、線紋尖塘鱧、河川沙塘鱧、鴨綠沙塘鱧精子的超微結(jié)構(gòu)進(jìn)行了比較研究。研究結(jié)果顯示：在掃描電鏡下云斑尖塘鱧、線紋尖塘鱧、河川沙塘鱧、鴨綠沙塘鱧精子均由頭部和尾部（即鞭毛）組成。2種尖塘鱧魚類精子頭部均為圓球形，而2種沙塘鱧精子頭部則為前端略方的長橢圓形；在透射電鏡下這4種蝦虎魚的精子均由頭部、中段（即頸部）和尾部（即鞭毛）3部分組成。頭部細(xì)胞核前端無頂體，細(xì)胞核后端的植入窩均較淺，中段不明顯，包括中心粒復(fù)合體和袖套。云斑尖塘鱧和線紋尖塘鱧的袖套中含有6～8個(gè)呈環(huán)形單層排列的線粒體，河川沙塘鱧和鴨綠沙塘鱧的袖套中含有2～3個(gè)線粒體。這4種蝦虎魚類精子尾部的鞭毛細(xì)長，軸絲均為典型的“9+2”型結(jié)構(gòu)，軸絲外側(cè)具有較發(fā)達(dá)的側(cè)鰭。

關(guān)鍵詞：蝦虎魚；精子；超微結(jié)構(gòu)；電子顯微鏡

中圖分類號(hào)： S961.2文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號(hào)：1002-1302（2015）11-0320-03

收稿日期：2014-12-16

基金項(xiàng)目：國家星火計(jì)劃（編號(hào)：2013GA690166）；江蘇省科技支撐計(jì)劃（編號(hào)：BE2013441）；江蘇省“六大人才高峰”高層次人才項(xiàng)目（編號(hào)：2012-NY-032）；海南大學(xué)科研基金（編號(hào)：kyqd1525）。

作者簡(jiǎn)介：王茜（1982—），女，博士，助理研究員，主要從事魚類遺傳育種研究。E-mail：wangqian170@163.com。

通信作者：尹紹，博士，教授，主要從事魚類遺傳育種研究。E-mail：yinshaowu@163.com。云斑尖塘鱧（Oxyeleotris marmoratus，俗稱泰國筍殼魚）和線紋尖塘鱧（Oxyeleotris lineolatus，俗稱澳洲筍殼魚），均隸屬于鱸形目（Perciformes）蝦虎魚亞目（Gobioidei）塘鱧科（Eleotridae）尖塘鱧屬（Oxyeleotris），分布于東南亞的江河、湖泊及水庫中，是塘鱧科乃至蝦虎魚亞目中體型大且生長快的淡水經(jīng)濟(jì)魚類。河川沙塘鱧（Odontobutis potamophila）和鴨綠沙塘鱧（Odontobutis yaluensis），均隸屬于鱸形目（Perciformes）蝦虎魚亞目（Gobioidei）沙塘鱧科（Odontobutidae）沙塘鱧屬（Odontobutis）。河川沙塘鱧是一種小型經(jīng)濟(jì)魚類，主要分布于我國長江中下游及沿江各支流、錢塘江水系、閩江水系。而鴨綠沙塘鱧是中小型溪流經(jīng)濟(jì)魚類，主要分布于鴨綠江中下游、遼河?xùn)|部山區(qū)支流太子河、大洋河和遼東半島碧流河[1]。因這4種蝦虎魚均具有肉質(zhì)細(xì)嫩鮮美、營養(yǎng)價(jià)值高、無肌間刺等諸多優(yōu)點(diǎn)，深受廣大消費(fèi)者喜愛。到目前為止，僅見胡亞麗等對(duì)云斑尖塘鱧精子的超微結(jié)構(gòu)[2]的報(bào)道。本研究采用掃描和透射電鏡對(duì)這4種魚類精子的超微結(jié)構(gòu)進(jìn)行觀察比較，為進(jìn)一步研究蝦虎魚類受精生物學(xué)、生殖生理特性等提供基礎(chǔ)依據(jù)。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

（1）云斑尖塘鱧雄魚：2011年4月15日購自海南斷山漁業(yè)有限公司三亞筍殼魚繁育基地，空運(yùn)至南京。水溫24～27 ℃暫養(yǎng)10～15 d后，選擇體質(zhì)健壯的雄魚進(jìn)行人工催產(chǎn)，劑量為每1 000 g體質(zhì)量注射LHRH-A2（促黃體生成激素釋放激素

8～15 μg[2]，或者每1 000 g 體質(zhì)量注射HCG（人絨毛膜促性腺激素）350～400 IU。（2）線紋尖塘鱧雄魚：2013年4月2日購自海南斷山漁業(yè)有限公司三亞筍殼魚繁育基地，空運(yùn)至南京。水溫24～27 ℃暫養(yǎng)7～10 d后，選擇體質(zhì)健壯的雄魚進(jìn)行人工催產(chǎn)，劑量為每尾注射PG（腦垂體） 1 mg+HCG 350～400 IU。（3）河川塘鱧雄魚：2012年3月15日購自江蘇省寶應(yīng)縣射陽湖鎮(zhèn)平江村宋涇河流域。水溫22～25 ℃暫養(yǎng)7～10 d后進(jìn)行人工催產(chǎn)，劑量為每1 000 g體質(zhì)量注射LHRH-A2 5～8 μg+ HCG 200～300 IU。（4）鴨綠沙塘鱧雄魚：2012年4月12日購自遼寧省撫順市新賓縣太子河流域，在江蘇省溧陽市金泉特種水產(chǎn)繁育場(chǎng)暫養(yǎng)20 d左右，于5月2日運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室。水溫20～23 ℃暫養(yǎng)5～7 d后進(jìn)行人工催產(chǎn)，劑量為每1 000 g體質(zhì)量注射LHRH-A2 2～4 μg+ HCG 250～350 IU。

達(dá)到效應(yīng)時(shí)間后，用干燥的毛巾將雄魚生殖孔處的水分擦凈，輕壓魚體腹部擠出精液，棄去最初擠出的精液，隨后用干凈的膠頭滴管吸取乳白色精液備用。

1.2方法

1.2.1掃描電鏡樣品制備掃描電鏡樣品制備，參照胡亞麗等的制備方法[2]。

1.2.2透射電鏡樣品制備先將精液放在預(yù)冷的2. 5%戊二醛中前固定，將精子懸液以1 000～2 000 r/min 離心1～2 min，棄去上清液，PBS 緩沖液漂洗5 min，重復(fù)3次。然后沉淀包埋于2%瓊脂中，包埋塊再放置于2. 5%戊二醛中 4 ℃ 過夜，PBS緩沖液漂洗10 min，重復(fù)3次。次日再進(jìn)行后固定，即轉(zhuǎn)入1%鋨酸后在4 ℃固定2 h。PBS緩沖液沖洗3次，每次10 min，丙酮梯度系列脫水，每級(jí)脫水15 min。采用Epon-812環(huán)氧樹脂滲透包埋，在35、45、60 ℃聚合爐中固化，每級(jí)24 h。用ULTRACUT E半薄切片機(jī)切片，厚度2 μm，甲苯胺藍(lán)染色，光鏡定位，再用LEICA ULTRACUT R超薄切片機(jī)切片，厚度約80 nm，經(jīng)醋酸雙氧鈾及檸檬酸鉛雙重染色后，用日立H-7650型透射電子顯微鏡進(jìn)行觀察和顯微攝影。

2結(jié)果與分析

2.1掃描電子顯微鏡觀察

2.1.1云斑尖塘鱧精子由頭部和尾部（鞭毛）2部分構(gòu)成。頭部呈圓球形，外表面凹凸不平呈波浪狀，其后緊接著由6～7個(gè)線粒體在軸絲周圍圍成的1圈；尾部自頭部后端的正中部向后延伸，纖細(xì)且長（圖1-1）。頭部直徑為1.98～2.12 μm，尾部鞭毛長23.22～32.92 μm[2]。

2.1.2線紋尖塘鱧精子由頭部和尾部構(gòu)成。頭部近似圓球形，表面不平且波紋稍深，明顯可見頭部后緊接著由7～8個(gè)線粒體在軸絲周圍圍成的1圈；細(xì)長的尾部鞭毛自頭部后端的正中向后延伸（圖1-2、圖1-3）。頭部直徑為1.68～2.08 μm，尾部鞭毛長16.01～25.32 μm。

2.1.3河川沙塘鱧精子由頭部和尾部構(gòu)成。頭部呈前端略方的長橢圓形，頭部外表面凹凸不平呈不規(guī)則的淺網(wǎng)格狀，其后緊接著由2～3個(gè)線粒體圍成的1圈；鞭毛自頭部后端的正中向后延伸（圖1-4）。頭部長徑為2.64～3.58 μm，短徑為1.13～1.50 μm，尾部鞭毛長27.45～36.42 μm。

2.1.4鴨綠沙塘鱧精子由頭部和尾部構(gòu)成。頭部呈前端略方的長橢圓形，中間略凹，頭部外表面紋路較淺，其后緊接著2～3個(gè)線粒體分布在鞭毛周圍；鞭毛從頭部后端的正中向后伸出（圖1-5）。頭部長徑為2.83～3.24 μm，短徑為1.38～1.60 μm，尾部鞭毛長19.57～27.98 μm。

2.2透射電子顯微鏡觀察

2.2.1云斑尖塘鱧精子由頭部、中段（頸部）和尾部（鞭毛）3部分組成。（1）頭部細(xì)胞核縱切面呈扁卵圓形，細(xì)胞核的后端正中有很淺的植入窩。核膜與質(zhì)膜間存在著較小的間隙，細(xì)胞質(zhì)膜表面呈凹凸不平狀。核內(nèi)的染色質(zhì)呈顆粒狀或短棒狀。染色質(zhì)中可見到數(shù)量很少的空隙（即核泡）。（2）中段（頸部）較短且不太明顯，其主要結(jié)構(gòu)是中心粒復(fù)合體（即近端中心粒和遠(yuǎn)端中心粒）及袖套。近端中心粒長軸與遠(yuǎn)端中心粒垂直，呈“T”字形。袖套中含有線粒體6～7個(gè)，呈單層環(huán)狀排列。線粒體內(nèi)可見清晰的線粒體嵴。在袖套的縱切面可見2～4個(gè)圓形線粒體（圖2-1），而橫切面可見6～7個(gè)線粒體（圖2-2）。（3）尾部（鞭毛）細(xì)長，從頭部后端很淺的植入窩伸出。鞭毛的軸絲具有典型的“9+2”型結(jié)構(gòu)（圖2-3），外周是9組二聯(lián)微管，中央是1組微管對(duì)。在鞭毛的橫切面上可見軸絲兩側(cè)具有發(fā)達(dá)的側(cè)鰭，側(cè)鰭的基部有囊泡[2]。

2.2.2線紋尖塘鱧精子由頭部、中段和尾部組成。（1）頭部縱切面呈卵圓形，后端正中有較淺的植入窩。細(xì)胞質(zhì)膜表面不平整，核膜與質(zhì)膜間的間隙較小，其間分布有細(xì)胞質(zhì)、囊泡、溶酶體等。核內(nèi)染色質(zhì)致密，呈顆粒或短棒狀。（2）中段較短且不明顯，主要包括中心粒復(fù)合體和袖套。袖套緊接于細(xì)胞核的后端，呈短圓筒狀，兩邊對(duì)稱，袖套中含有線粒體 7～8個(gè)，呈單層環(huán)狀排列，線粒體內(nèi)的線粒體嵴清晰可見。袖套的縱切面可見3～4個(gè)圓形線粒體（圖2-4），而橫切面可見7～8個(gè)線粒體（圖2-5）。（3）尾部細(xì)長，從植入窩中伸出，鞭毛的軸絲具有典型的“9+2”型結(jié)構(gòu)，其橫切面可見軸絲兩側(cè)發(fā)達(dá)的側(cè)鰭。

2.2.3河川沙塘鱧精子由頭部、中段和尾部組成。（1）頭部細(xì)胞核縱切面呈前端略方的長橢圓形，頭部后端正中部位有1個(gè)較淺的植入窩，凹陷約為頭部的1/6（圖2-6）。核膜與質(zhì)膜間有小間隙，核內(nèi)的染色質(zhì)致密呈顆粒狀，染色質(zhì)中可見到數(shù)量較少的空隙。（2）中段較短且不太明顯，主要包含中心粒復(fù)合體和袖套。袖套中含有線粒體2～3個(gè)，環(huán)狀排列在軸絲周圍，線粒體內(nèi)可見清晰的線粒體嵴。在精子的縱切面可見2個(gè)圓形線粒體（圖2-6），在袖套的橫切面可見2個(gè)線粒體（圖2-7）。（3）尾部細(xì)長，從頭部后端較淺的植入窩伸出。鞭毛的軸絲具有典型的“9+2”型結(jié)構(gòu)，在鞭毛的橫切面上可見軸絲兩側(cè)具有發(fā)達(dá)的側(cè)鰭。

2.2.4鴨綠沙塘鱧精子由頭部、中段和尾部構(gòu)成。（1）頭部縱切面呈長橢圓形，前端一側(cè)略方。頭部后端正中部位有1個(gè)較淺的植入窩，凹陷為頭部的1/5～1/4。核膜與質(zhì)膜間有小間隙，核內(nèi)的染色質(zhì)致密，呈顆粒狀，染色質(zhì)中可見到少量的空隙。（2）中段較短且不明顯，包括中心粒復(fù)合體和袖套。袖套中含有線粒體2～3個(gè)，環(huán)狀排列呈1圈，線粒體內(nèi)可見清晰的線粒體嵴。在精子的縱切面可見2個(gè)圓形線粒體（圖2-8）。③尾部細(xì)長，從頭部后端伸出。鞭毛的軸絲由遠(yuǎn)端中心粒向外延伸，具有典型的“9+2”型結(jié)構(gòu)，軸絲兩側(cè)具有側(cè)鰭。

3討論

通過對(duì)云斑尖塘鱧、線紋尖塘鱧、河川沙塘鱧、鴨綠沙塘

鱧精子的超微結(jié)構(gòu)進(jìn)行比較， 發(fā)現(xiàn)它們有以下相同點(diǎn)和不同之處。相同的是，在掃描電鏡下觀察，精子均由頭部和尾部（鞭毛）構(gòu)成。在透射電鏡下觀察，精子均由頭部、中段和尾部構(gòu)成，中段較短且不太明顯；精子頭部的前端均沒有頂體結(jié)構(gòu)；尾部軸絲均具有典型的“9+2”型結(jié)構(gòu)；精子鞭毛的軸絲兩側(cè)均具有發(fā)達(dá)的側(cè)鰭。不同的是，在掃描電鏡下云斑尖塘鱧和線紋尖塘鱧精子頭部均呈圓球形，而河川沙塘鱧和鴨綠沙塘鱧精子頭部呈前端略方的長橢圓形；云斑尖塘鱧和線紋尖塘鱧頭部細(xì)胞核中染色質(zhì)致密，只見到數(shù)量很少的空隙（即核泡），鴨綠沙塘鱧染色質(zhì)中見到的核泡稍多些，而河川沙塘鱧中見到的核泡則相對(duì)較多；在透射電鏡下，云斑尖塘鱧和線紋尖塘鱧的袖套中含有線粒體數(shù)量較多（為6～8個(gè)），呈單層環(huán)狀排列，而河川沙塘鱧及鴨綠沙塘鱧袖套中僅含有線粒體2～3個(gè)，排列在軸絲的周圍；云斑尖塘鱧和線紋尖塘鱧的植入窩最淺，河川沙塘鱧的植入窩較淺，凹陷約為頭部的1/6，鴨綠沙塘鱧的植入窩相對(duì)較深，凹陷為頭部的1/5～1/4；從精子的鞭毛長度來看，河川沙塘鱧最長（27.45～36.42 μm）、云斑尖塘鱧次之（23.22～32.92 μm），鴨綠沙塘鱧再次之（19.57～27.98 μm），線紋尖塘鱧最短（16.01～25.32 μm），但均比同為塘鱧科的中華烏塘鱧精子的鞭毛（15.5～17.5 μm）[3]要長。比較這4種蝦虎魚類精子的超微結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)，同屬中2種蝦虎魚類的精子超微結(jié)構(gòu)相似，而不同屬的蝦虎魚類間精子超微結(jié)構(gòu)存在較大差異，這與同屬的魚類親緣關(guān)系較近相一致。

在云斑尖塘鱧、線紋尖塘鱧、河川沙塘鱧、鴨綠沙塘鱧精子的超微結(jié)構(gòu)中可以看到，與大多數(shù)硬骨魚類一樣，精子頭部前端均無頂體結(jié)構(gòu)[4]。在透射電鏡下4種蝦虎魚類精子頭部呈扁卵圓形或橢圓形，這與大多數(shù)體外受精硬骨魚類的精子頭部相近，如草魚和興國紅鯉[5]，而與江黃顙魚[6]不同，其精子頭部呈馬鞍形。對(duì)黃顙魚[7]和長吻[8]的研究發(fā)現(xiàn)，它們均具有非常發(fā)達(dá)的植入窩，黃顙魚的植入窩呈井狀，長吻的植入窩極深，凹入深度約為精子頭部長徑的5/6，而4種蝦虎魚類精子頭部的植入窩均較淺。在長吻[8]和褐菖鲉[9]中，其袖套中分別含有16個(gè)或30～40個(gè)線粒體，且呈多層排列，而4種蝦虎魚類精子的袖套線粒體數(shù)量較少，且呈單層排列。4種蝦虎魚精子的鞭毛軸絲均具有典型的“9+2”型雙聯(lián)管結(jié)構(gòu)，而長薄鰍等[10]的尾部則為“9+3”式微管結(jié)構(gòu)。與黃顙魚[7]、長吻[8]、褐菖鲉[9]等相同，這4種蝦虎魚類精子的尾部軸絲兩側(cè)都有比較發(fā)達(dá)的側(cè)鰭，而有些魚類的精子則無側(cè)鰭，如鯉魚[11]、刀鱭[12]等。鞭毛是精子的運(yùn)動(dòng)器官，Stoss[13]認(rèn)為側(cè)鰭可能改善精子鞭毛的游泳速率，有利于提高受精率，而Afzelius[14]則認(rèn)為側(cè)鰭與精子游泳速率的提高無多大關(guān)系，側(cè)鰭的有無是否影響精子的游泳速率，從而影響受精效率，不同學(xué)者存在不同的看法。

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