馬尾藻多糖脂質體納米制劑對南美白對蝦抗病力的影響

崔月明　胡庭俊　秦津等

摘要：研究馬尾藻多糖脂質體對南美白對蝦免疫功能及抗病毒活性的影響。首先，選用72尾SPF南美白對蝦，分為脂質體組和對照組，飼喂7 d后，測血淋巴上清中總蛋白含量，酚氧化酶、溶菌酶、堿性磷酸酶和酸性磷酸酶活性；然后，選用2批180尾SPF南美白對蝦分別觀察多糖脂質體對感染白斑綜合征病毒或桃拉病毒對蝦的保護作用，將180尾對蝦隨機分為6組，設空白對照組、陽性對照組，藥物陽性對照組和高、中、低3個脂質體劑量組，飼喂7 d后攻毒，攻毒后觀察7 d，記錄發病數、死亡數。結果表明，在免疫試驗中，脂質體組酚氧化酶、溶菌酶和堿性磷酸酶的活性極顯著升高；在抗病毒保護試驗中，多糖脂質體各劑量均能提高南美白對蝦的存活率，高劑量組存活率最高。說明馬尾藻多糖脂質體對南美白對蝦具有免疫促進作用，并能提高其抗病力。

關鍵詞：馬尾藻多糖；脂質體；南美白對蝦；免疫；病毒病

中圖分類號：S945.4+9 文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2015）11-0323-03

收稿日期：2014-11-20

基金項目：廣西科學研究與技術開發計劃（編號：桂科攻0992014-6）。

作者簡介：崔月明（1980—），女，河南南陽人，博士研究生，講師，研究方向多糖免疫藥理學。E-mail：870180417@qq.com。

通信作者：胡庭俊，博士，教授，研究方向為中藥免疫藥理學。E-mail：tingjunhu@126.com。對蝦白斑綜合征（WSS）和桃拉綜合征（TS）是危害我國對蝦養殖業最多的兩大病毒病，其大面積的暴發嚴重危害了對蝦養殖業的發展。2001—2006年對南美白對蝦養殖的主產地10個省份的流行病學調查研究顯示，在所有檢測到的病毒性疾病中白斑綜合征病毒（WSSV）占63.84%，桃拉綜合征病毒（TSV）占32.74%，成為危害最大的2種病毒病，并且其死亡率也呈現逐年遞增的趨勢[1]。2009—2010年在福建、海南和廣東的流行病學調查中，對蝦WSSV的陽性結果占27.1%，它和傳染性皮下及造血組織壞死病毒（IHHNV）同時呈現陽性的占16.95%[2]。針對這種病毒性疾病的大面積暴發，目前還沒有有效的救治方法，因此對病毒病的有效防治已成為對蝦養殖中的最主要問題[3]。對蝦和其他無脊椎動物一樣， 缺乏脊椎動物特異的抗原/抗體免疫反應機制， 雖然一些病毒的重組蛋白能夠誘導特異的免疫反應，但這種保護作用只是暫時的[4]，因此完全寄希望于通過疫苗免疫來控制蝦病是不切實際的。目前對病毒病的防治還是以防為主，報道稱中草藥類多糖、生物堿、有機酸、酮類等以及益生菌能激活對蝦的免疫系統， 增強抗病力，從而達到防病治病的目的[5]。楊明用烏梅為主要材料的中藥抗病毒復方飼喂南美白對蝦，其中2%劑量的試驗組促進對蝦的生長最明顯，酚氧化酶（PO）和過氧化物酶活性亦大大提高，表明中藥復方能提高對蝦的非特異性免疫力；在WSSV感染試驗中，免疫保護率更是達到61.98%，效果極顯著[6]。

馬尾藻多糖（SP）作為海藻中一類具有較高抗病毒活性的硫酸多糖，添加在飼料中，不僅能促進南美白對蝦的生長，而且對甲殼動物的酚氧化酶系統具有激活作用，能提高南美白對蝦酸性磷酸酶（ACP）、 超氧化物歧化酶（SOD）及溶菌酶（LSZ）活性，并且在感染WSSV后，使免疫保護率從28%提高到74%[7]。脂質體是將藥物包封于類脂質雙分子層而制成的一種超微型球狀藥物載體制劑，結構類似生物膜，和靶細胞之間可通過內吞、融合、接觸釋放、吸附、脂質交換等方式起作用，具有減少藥物治療劑量、降低藥物毒性、減輕變態反應和免疫反應、延緩釋放、靶向給藥等優點[8]。多糖脂質體作為免疫增強劑在提高對蝦的非特異性免疫，增強對病毒性疾病的抵抗力方面，目前國內外都未見報道。馬尾藻多糖脂質體納米制劑（SPL）是將溶解的馬尾藻多糖包封于磷脂雙層膜中，形成穩定的球形納米乳劑。本試驗通過在南美白對蝦飼料中添加SPL，測定對蝦血淋巴液上清中總蛋白（TP）含量，酚氧化酶、溶菌酶、堿性磷酸酶（ALP）和酸性磷酸酶的活性，探討SPL對南美白對蝦非特異性免疫功能的調節作用；而后人工感染WSSV和TSV，觀察SPL對南美白對蝦抗病力的影響，評價SPL作為免疫增強劑在對蝦養殖中的作用，為SPL的進一步推廣應用提供依據。

1材料與方法

1.1試驗材料

1.1.1藥物0.5%馬尾藻多糖脂質體納米制劑，由廣西大學動物科學技術學院制備。對照藥：鹽酸左旋咪唑+黃芪多糖可溶性粉，湖南湘大獸藥有限公司生產，商品名為瘟毒清，生產批號為20110680。

1.1.2試驗動物SPF南美白對蝦的幼蝦500尾，取自廣西水產研究所南美白對蝦企沙養殖基地，暫養7 d后量體長、稱質量，體長為（4.5±0.55） cm，體質量為（0.69±0.31） g，挑選規格基本一致的用于試驗。

1.1.3飼料對蝦飼料為豆粕、魚粉、面粉、蝦粉、魚油、麥麩、多維多礦、大豆磷酯組成的對蝦基礎飼料，試驗組按不同劑量將SPL噴涂于飼料上。

1.1.4病毒對蝦白斑病綜合征病毒、桃拉綜合征病毒均由廣西壯族自治區水產研究所保存，二者的TCID50均為10-6。

1.2試驗方法

1.2.1試驗分組及處理將72尾SPF南美白對蝦分為2組——對照組和SPL組。對照組飼喂基礎飼料，SPL組飼料添加SPL 50 mL/kg，連續飼喂7 d。2組分別飼養于150 cm×80 cm×60 cm的水族箱內，上午、下午各投料1次（按對蝦體質量的5%投料），常溫下喂養。

1.2.2血淋巴液制備用藥后8 d，用帶5號針頭的1 mL注射器自蝦的頭胸甲后插入心臟取血淋巴液0.3 mL，置于 Eppendorf 管中，4 ℃冷藏，3 000 r/min 離心10 min，取上清用于免疫指標測定。

1.2.3免疫指標測定用南京建成生物工程研究所的試劑盒測定對蝦血淋巴液上清中總蛋白含量，以及溶菌酶、堿性磷酸酶和酸性磷酸酶活力；酚氧化酶活性用改進的Ashida方法[9]，以L-dopa為底物，反應時間6 min，測定490 nm下的吸光度。

1.2.4攻毒保護試驗將360尾SPF南美白對蝦分成2大組，分別做SPL對WSSV和TSV的攻毒保護試驗。將每大組的180尾SPF南美白對蝦隨機分為6組， 每組30尾，分別是空白對照組、病毒陽性對照組、藥物對照組以及多糖脂質體納米制劑的高（200 mL/kg）、中（100 mL/kg）、低（50 mL/kg）劑量組，分別飼養于150 cm×80 cm×60 cm的水族箱內。上午、下午各投料1次（按對蝦體質量的5%投料），在常溫下喂養7 d，飼喂8 d時按100倍TCID50的病毒量進行攻毒試驗。攻毒后觀察7 d，記錄發病數和死亡數，計算相對保護率：相對保護率=（1-試驗組死亡率/病毒對照組死亡率）×100%。

1.2.5數據處理及統計分析采用統計學軟件SPSS 16.0 進行數據的顯著性檢驗，免疫指標用獨立性t檢驗，抗病毒保護試驗用χ2檢驗。

2結果與分析

2.1SPL對南美白對蝦相關免疫指標的影響

SPL對SPF南美白對蝦免疫指標的影響結果見表1。添加SPL的試驗組總蛋白含量與對照組差異不顯著，而其余的相關免疫酶活性均有較大的改變，其中酸性磷酸酶活性極顯著降低（P<0.01），酚氧化酶、溶菌酶和堿性磷酸酶活性極顯著升高（P<0.01）。

2.2SPL對人工感染WSSV的南美白對蝦的抗感染保護作用

在對蝦飼料中添加SPL后，高、中、低劑量組與病毒對照組相比都降低了發病率和死亡率。其中藥物對照組和SPL中劑量組的死亡數顯著減少（P<0.05），SPL高劑量組死亡數極顯著減少（P<0.01），相對保護率最高，達到16.67%（表2）。

2.3SPL對人工感染TSV的南美白對蝦的抗感染保護作用

由表3可見，在飼料中添加中、高劑量的SPL能顯著提高南美白對蝦對TSV的抵抗力，使發病數顯著降低（P<0.05）。SPL組的相對保護率均高于藥物對照組，其中高劑量組最高，達到26.93%。

3討論

對蝦屬于甲殼動物，其免疫防御系統由基本防御屏障（甲殼和表皮）、細胞防御屏障（血淋巴細胞免疫）和生理防御屏障（體液免疫）3個部分組成。對蝦的體液免疫包含水解和氧化等酶類、凝集素、抗菌肽、溶菌酶等體液免疫因子，它們在甲殼動物的體液免疫過程中發揮著很大的作用，使得甲殼動物能識別非己物質，抵抗病原體的侵襲。

對蝦的酚氧化酶系統（proPO）作為一種非特異性識別體系是先天性體液免疫的重要組成之一，無論從組成、激活方式還是免疫功能上，都非常類似于高等動物的補體系統，主要是通過酚氧化酶原激活系統、抗菌肽和凝集素等的作用達到抗病抑菌及消除異物的目的。本研究發現，在對蝦飼料中添加50 mL/kg 劑量的SPL可以極顯著增強南美白對蝦血淋巴上清中的PO活性，與對照組相比PO活性提高2倍以上，說明SPL能夠有效刺激大顆粒細胞脫顆粒，從而釋放出酚氧化酶原激活系統的各種組分，參與免疫識別及免疫防御反應。

溶菌酶是對蝦血細胞吞噬異物后分泌的一些堿性蛋白質，主要水解細菌細胞壁的糖苷鍵，引起細菌細胞裂解死亡，破壞和消除侵入體中的異物。本試驗結果顯示，飼喂含SPL的飼料7 d后，LSZ的活力極顯著升高。與劉小玲等研究的樺褐孔菌多糖以及覃振林等研究的馬齒莧對對蝦非特異性免疫的效果[10-11]一致。

磷酸酶可以催化磷酸單脂的水解反應和磷酸基團的轉移反應，從而將表面帶有磷酸單酯的異物破壞降解。依據它們起催化作用的最適pH值不同，分為堿性磷酸酶和酸性磷酸酶。在本試驗中，同時測定了對蝦血淋巴上清液中ALP與ACP的活性，與對照組相比均有極顯著差異，說明SPL影響了磷酸酶的分泌和活性。其中ALP是極顯著升高，與大多數相關的研究結果[10，12]一致，而ACP的含量卻是極顯著降低，這可能與飼喂時間以及對蝦的生長期有關。李桂英等在對蝦飼料中添加腸道益生菌后發現，根據飼喂的時間不同，ACP的活性在各個時間點有較大的差異，在第10天達到最高，之后就下降了[13]；王新霞用β-葡聚糖飼喂幼蝦，在第9天的時候活性明顯升高，而在第14天測定時活性就下降了，甚至低于對照組[14]。除了時間因素外，還可能與脂質體的主要組成是磷脂和膽固醇有關，因為磷脂可被磷酸酶水解，二者之間可以發生化學反應。所以，本研究測定的ACP含量降低的原因還需要進一步探討。

病毒感染對蝦之后，會引起對蝦的免疫防御反應[15-16]。WSSV可感染對蝦顆粒細胞，使超氧化物歧化酶、過氧化氫酶和誘導性一氧化氮合成酶的活性顯著降低[17]；WSSV也能使對蝦的酚氧化酶體系明顯上調，對蝦痊愈后其酚氧化酶活性降到正常值[18]，暗示病毒也會激活酚氧化酶體系，進而啟動對蝦的免疫反應。在TSV感染2～3 d后，對蝦總淋巴細胞數、透明細胞數、半顆粒細胞數及顆粒細胞數都有大幅度下降，SOD、PO活性分別下降了約 25%、68%，這表明TSV可能通過降低對蝦血液學免疫力而實現其高致病性[19]。Chang等研究發現，多糖類物質（如β-葡聚糖、脂多糖、肽聚糖等）能有效激活對蝦的酚氧化酶系統，進而提高對蝦自身的免疫水平，抑制體內病毒擴增，阻止未帶毒個體染病，從而預防控制WSSV感染[20]。本研究利用具有抗病毒活性的馬尾藻硫酸多糖制成的脂質體納米制劑作為免疫增強劑，觀察對WSSV和TSV感染后對蝦的保護作用發現，SPL高劑量組可以極顯著減少病死蝦的數量，對WSSV感染后保護率達1667%，對TSV感染后保護率達26.93%。

本試驗結果顯示，飼料添加SPL 50 mL/kg，能顯著提高南美白對蝦的酚氧化酶、溶菌酶、堿性磷酸酶活性，對對蝦的非特異性免疫具有免疫促進作用。在人工感染WSSV和TSV后，高、中、低劑量的SPL對南美白對蝦均有一定的保護作用，效果優于對照藥物瘟毒清，其中高劑量組保護效果最好。說明脂質體作為一種新型的藥物制劑，可以增強甲殼類動物的免疫活性，提高其抗病毒能力，有作為綠色免疫增強劑開發的潛力。

參考文獻：

[1]朱澤聞，陳愛平，李文旭，等. 南美白對蝦兩大病毒病流行分析及趨勢預測[J]. 科學養魚，2007（4）：49-50.

[2]林開，侯崇林，謝榮輝，等. 三種對蝦病毒在浙江省凡納濱對蝦中的流行性調查研究[J]. 水產科學，2013（3）：161-164.

[3]王蔚，章曉波. 對蝦-病毒互作的分子機制研究[J]. 生命科學，2010，22（11）：1102-1106.

[4]Rout N， Kumar S， Jaganmohan S， et al. DNA vaccines encoding viral envelope proteins confer protective immunity against WSSV in black tiger shrimp[J]. Vaccine，2007，25（15）：2778-2786.

[5]謝芝勛. 對蝦病毒病研究進展[J]. 動物醫學進展，2003，24（2）：27-30.

[6]楊明. 中草藥制劑在凡納濱對蝦抗病性能中的應用研究[D]. 廈門：集美大學，2012.

[7]何穎，陳忠偉，高建峰，等. 馬尾藻多糖對南美白對蝦免疫調節作用[J]. 安徽農業科學，2008，36（31）：13664-13665， 13680.

[8]姜華，高原，楊景明. 中藥脂質體的研究進展[J]. 當代醫學，2009（28）：12-13.

[9]Ashida M， Sderhll K. The prophenoloxidase activating system in crayfish[J]. Comparative Biochemistry and Physiology Part B：Comparative Biochemistry，1984，77（1）：21-26.

[10]劉小玲，徐向群，黃燕華，等. 樺褐孔菌多糖對凡納濱對蝦生長和血清免疫相關酶活性的影響[J]. 水產科學，2014（4）：201-207.

[11]覃振林，韋海英，李學堅，等. 復方馬齒莧影響南美白對蝦非特異性免疫功能研究[J]. 水利漁業，2006（5）：100-101.

[12]文國樑，林黑著，李卓佳，等. 飼料中添加復方中草藥對凡納濱對蝦生長、消化酶和免疫相關酶活性的影響[J]. 南方水產科學，2012（2）：58-63.

[13]李桂英，宋曉玲，孫艷，等. 幾株腸道益生菌對凡納濱對蝦非特異免疫力和抗病力的影響[J]. 中國水產科學，2011，18（6）：1358-1367.

[14]王新霞. 對蝦免疫增強劑的研究與應用[D]. 青島：中國海洋大學，2004.

[15]杭小英，周志明，李倩，等. 不同養殖模式對南美白對蝦生長、病害發生與水質的影響[J]. 江蘇農業科學，2014，42（5）：191-193.

[16]胡振雄，劉利平. 凡納濱對蝦綜合養殖的分類、存在問題及對策[J]. 江蘇農業科學，2013，41（10）：202-204.

[17]宋曉玲，黃倢，王秀華，等. 白斑綜合征病毒感染與對蝦的免疫防御反應[J]. 中國水產科學，2006，13（6）：1033-1039.

[18]Sarathi M， Basha A N， Ravi M， et al. Clearance of white spot syndrome virus （WSSV） and immunological changes in experimentally WSSV-injected Macrobrachium rosenbergii[J]. Fish & Shellfish Immunology，2008，25（3）：222-230.

[19]金立方，余招鋒. 桃拉病毒感染對南美白對蝦血液學參數的影響[J]. 農業與技術，2013（10）：14-16， 69.

[20]Chang C F， Su M S， Chen H Y， et al. Dietary beta-1，3-glucan effectively improves immunity and survival of Penaeus monodon challenged with white spot syndrome virus[J]. Fish & Shellfish Immunology，2003，15（4）：297-310.唐忠林，茆健強，周國勤，等. 黃顙魚工廠化育苗技術[J]. 江蘇農業科學，2015，43（11：326-327，403.