桑屬植物的葉表皮特征及其分類學意義

任強　楊曉紅　鄒義冬等

摘要：在光學顯微鏡下觀察桑屬（Morus.）8個種葉表皮形態(tài)特征。結(jié)果表明：桑屬植物上表皮細胞排列規(guī)則，形狀為多邊形，垂周壁平直；下表皮細胞較窄長，排列不規(guī)則，垂周壁微波狀起伏。桑葉上、下表皮有非腺毛、腺毛、鐘乳體等附屬物的分布。桑葉柵欄組織細胞的排列相對緊密且規(guī)則，而海綿組織細胞排列松散且不規(guī)則，葉肉細胞中還有大量晶體，鐘乳體形狀多樣，上下表皮中都有分布。氣孔器僅分布在葉下表皮，屬于無規(guī)則型，氣孔圓形或橢圓形。氣孔面積、氣孔形態(tài)及表皮毛等特征存在一定的種間差異，可以作為桑屬植物分類的重要依據(jù)。桑屬植物葉表皮特征作為該屬種間鑒定的指標是可行的，但是依據(jù)某個單一的形態(tài)特征形狀，并不能將各個種之間完全區(qū)分開，應該綜合多種形態(tài)性狀進行分析。

關(guān)鍵詞：桑屬植物；葉表皮；形態(tài)特征；垂周壁；氣孔器；分類

中圖分類號： S888.2文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2015）11-0328-06

收稿日期：2014-11-19

基金項目：國家自然科學基金（編號：21107014）；江西省自然科學基金（編號：2009GZH0008）。

作者簡介：任強（1982—），男，山東濟南人，碩士，講師，主要從事植物生物學和生物技術(shù)研究。E-mail：88545866@qq.com。近幾十年來，許多研究發(fā)現(xiàn)葉表皮細胞形狀和氣孔器特征在一定程度上能夠反映分類群間的系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系，可以用于科以下屬間或?qū)僖韵路N間關(guān)系的探討[1-3]。葉表皮及葉結(jié)構(gòu)特征作為一個重要的分類和系統(tǒng)演化的性狀已用于多個類群的研究并取得良好的效果[4-10]，均說明葉表皮和氣孔器特征是植物系統(tǒng)分類和親緣關(guān)系鑒定的重要指標。

關(guān)博夫曾觀察比較了桑葉氣孔的形態(tài)，發(fā)現(xiàn)氣孔的大小、多少與桑樹染色體的倍性密切相關(guān)[11]。余茂德等曾對桑葉氣孔的形態(tài)進行觀察，結(jié)果表明，桑葉氣孔的大小、多少與染色體倍數(shù)呈規(guī)律性變化[12]。劉云等運用光學顯微鏡和掃描鏡對11種蠶用桑品種的葉表皮形態(tài)和結(jié)構(gòu)進行過觀察研究，認為葉表皮細胞和氣孔器特征在該屬植物分類中具有一定的作用[13]。作為桑屬形態(tài)分類重要輔助手段的葉表皮的微形態(tài)特征，至今尚無人進行過系統(tǒng)研究。本研究利用光學顯微鏡觀察桑屬8個種代表植物葉表皮形態(tài)特征，旨在為桑屬植物的系統(tǒng)研究提供微形態(tài)學資料，對該屬分類學上的部分問題作初步探討。

1材料和方法

1.1試驗材料

取材時間為09：00—10：00，材料選取桑屬8個品種，分別標記為1號白桑（Morus alba Linn.）、2號廣東桑（M.atropurpurea Roxb.）、3號雞桑（M.australis Poir.）、4號華桑（M.cathayana Hemsl.）、5號山桑（M.bombycis Koidz.）、6號蒙桑（M.mongolica Schneid.）、7號長穗桑（M.wittiorum Hand Mazz.）和8號川桑（M.notabillis Schneid.），果期的第3張至第5張成熟葉片作為研究對象。

1.2玻片標本的制作

1.2.1桑葉表皮離析整體制片剪取若干葉片中部近主脈處0.5 cm×0.5 cm的小塊，用蒸餾水漂洗干凈，放入Jeffery 離析液（鉻酸 ∶硝酸=1 ∶1）中[14]于70 ℃溫箱離析1～1.5 h，直至材料周緣泛白，葉肉與葉表皮開始分離，蒸餾水漂洗后，用毛筆清除上下表皮間的葉肉，用1%番紅染色，經(jīng)乙醇系列脫水后，固綠對染，乙醇繼續(xù)脫水，二甲苯透明，整體封片，加拿大樹膠封片。

1.2.2桑葉石蠟切片法顯微制片取FAA固定好的材料，用蒸餾水漂洗3次，洗去固定液，1%番紅過夜整染，蒸餾水漂洗后。經(jīng)乙醇系列脫水，先從低濃度的乙醇開始，然后遞增濃度，直至無水乙醇，各級乙醇1～2 h。將脫水后的材料經(jīng)1/2二甲苯到二甲苯，各級時間為1～2 h。浸蠟2～4 h，石蠟包埋，旋轉(zhuǎn)式切片機切片，切片厚度8 μm。脫蠟后用固綠對染，乙醇系列脫水，二甲苯透明，加拿大樹膠封片。

1.3觀察、測量和統(tǒng)計

在數(shù)碼顯微影像系統(tǒng)（DMBA400，中國Motic公司生產(chǎn)）中觀察、照相、測量。對上下表皮細胞進行觀察，對細胞的形狀、垂周壁特征、鐘乳體細胞、表皮毛等進行觀察、統(tǒng)計和照相。在相同倍數(shù)下（目鏡10×，物鏡40×），對每個種隨機測量10個視野，每視野測20個氣孔器，觀察統(tǒng)計氣孔器及鐘乳體細胞數(shù)量，取得平均值。氣孔器面積=氣孔器長軸長×短軸長；氣孔密度=觀察面積內(nèi)氣孔器個數(shù)/觀察面積。本研究所用術(shù)語參考文獻[10，15-17]。利用SPSS 11.5軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析[19]。

2結(jié)果與分析

2.1桑屬葉表皮共有特征

在光學顯微鏡下，對桑葉表皮離析、桑葉橫切面進行觀察，結(jié)果（圖1）顯示，桑葉上表皮細胞排列規(guī)則、形狀為多邊形（polygonal）、垂周壁平直（straight）、無細胞間隙（圖1-A）；下表皮細胞較窄長，排列不規(guī)則（圖1-B），垂周壁微波狀起伏；桑葉橫切面顯示，在細胞表面之間還沉積著1層厚的角質(zhì)層（圖1-C、圖1-D）。

葉離析材料觀察結(jié)果表明，在桑葉的表皮中還分布大量的表皮附屬物，下表皮有或無毛，毛分非腺毛（圖1-E、圖1-F）和腺毛（圖1-G）2種，非腺毛為單細胞，稀疏、長短、粗細不一，表皮毛的形態(tài)特征有一定的種間差異。腺毛頭狀，由多細胞組成，由窄柄頂端膨大的分泌細胞組成的囊狀毛，柄由1個（有時幾個）細胞和1個基細胞組成（圖1-G）。

表皮細胞中還存在一類特殊的細胞，有研究者稱之為巨大細胞[19]，細胞形狀似球形，胞內(nèi)可見1個清晰的晶狀體結(jié)構(gòu)，稱為鐘乳體（圖1-H至圖1-M），為碳酸鈣性質(zhì)的晶體[13]。鐘乳體形狀多樣，如圓柱形（圖1-I）、扇形（圖1-J）等。鐘乳體細胞在上下表皮中都有，但上表皮分布相對較多（圖1-I至圖1-K），表皮毛細胞中也有鐘乳體的存在（圖1-L，1-M）。

氣孔器主要是由2個保衛(wèi)細胞和它們之間的開口共同組成（圖1-N、圖1-O）。氣孔器形態(tài)特征在桑屬內(nèi)比較穩(wěn)定，只分布在下表皮，無規(guī)則型，氣孔的形狀多為橢圓形或圓形。但氣孔面積存在種間差異。

葉肉表皮細胞內(nèi)側(cè)為由薄壁細胞組成的葉肉。桑葉的葉肉由柵欄組織和海綿組織組成，柵欄組織細胞的排列相對緊密且規(guī)則，而海綿組織細胞排列松散且不規(guī)則（圖1-L、圖1-M、圖1-P、圖1-R），葉肉細胞中還分布大量的晶體（圖1-R）。

主脈的最外層表皮細胞排列非常緊密，表面覆蓋1層厚的角質(zhì)層，葉脈表皮細胞內(nèi)側(cè)為機械組織，具支持作用。機械組織以內(nèi)為薄壁細胞。其內(nèi)為維管束，由木質(zhì)部和韌皮部組成，木質(zhì)部較發(fā)達，在橫切面上呈近圓形，導管呈輻射環(huán)狀排列；韌皮部位于木質(zhì)部外側(cè)（圖1-Q），因此桑葉維管束的排列方式為外韌維管束。

2.2桑屬各個種葉表皮特征

從圖2可以看出，桑屬植物氣孔器形狀分為圓形（圖2-A、圖2-B、圖2-G）和橢圓形（圖2-C至圖2-F、圖2-H）2種類型，除白桑、廣東桑、長穗桑外，其余種都是橢圓形。如表1所示，氣孔面積在桑屬內(nèi)存在顯著差異，氣孔面積最大的種為華桑，達（143.82±8.85） μm2；氣孔面積最小的為山桑，達 （76.22±4.42） μm2 。種間氣孔密度也有一定差異，氣孔密度最大種為長穗桑，達（1 614±21） 個/mm2；氣孔密度最小的種為蒙桑，達 （1 098±12） 個/mm2 。

利用光學顯微鏡對葉片上表皮鐘乳體細胞頂面進行觀察，統(tǒng)計其鐘乳體細胞數(shù)量。不同種的鐘乳體細胞形態(tài)各異，大多數(shù)鐘乳體細胞頂面為球形（圖2-I至圖2-L、圖2-N至圖2-P），如白桑、廣東桑、雞桑、華桑、蒙桑、長穗桑、川桑；少數(shù)呈梯形狀（圖2-M），如山桑。有些研究者曾根據(jù)鐘乳體細胞的形狀來對不同品種的桑樹進行分類[13，19]。表1顯示，在上表皮細胞中鐘乳體細胞最多的是長穗桑，為 （10.50±0.79） 個/mm2 ；分布最少的是蒙桑，為 （7.50±009） 個/mm2。

采用光學顯微鏡對葉表皮上的表皮毛進行觀察，發(fā)現(xiàn)表皮上的非腺毛形態(tài)各異（圖2-Q至圖2-X），在種間存在顯著性差異（表2）。長穗桑無表皮毛分布，在葉表皮上偶見有直或彎曲的瘤狀小突起（圖2-Q）。蒙桑無表皮毛分布（圖2-R）。川桑表皮毛疏生，基部顯著膨大，先端銳尖，整個毛形呈三角形（圖2-S），表皮毛長度為21.9～75.6 μm，基部寬度為19.6～33.9 μm。白桑表皮毛疏生，基部近扁圓球形顯著膨大，尾尖漸細，整個毛形呈長漏斗狀（圖2-T），表皮毛長度為23.6～49.2 μm，基部寬度為12.5～28.8 μm。山桑表皮毛與白桑相似，分布較少，基部突然顯著膨大，先端尾尖，毛呈短漏斗形或長圓錐狀（圖2-U），表皮毛長度為 16.2～32.5 μm ，基部寬度為12.7～23.8 μm。廣東桑表皮毛基部膨大，先端漸尖，有彎刀狀和漏斗狀2種類型（圖2-V），表皮毛長度為25.5～62.2 μm，基部寬度為 17.5～25.2 μm 。雞桑毛中下部橢圓形膨大近等粗，漸尖，先端漸尖，直或彎曲（圖2-W），表皮毛長度為 24.2～169.8 μm ，基部寬度為19.9～36.9 μm。華桑表皮毛密生，柔軟，基部不膨大、較長、有彎曲（圖2-X），表皮毛長度為207.5～352.1 μm，基部寬度為10.6～30.2 μm。

3討論

3.1桑屬植物葉表皮及葉肉性狀具有相似性

在光學顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，所研究的8個桑種上表皮細胞排列規(guī)則、形狀為多邊形、垂周壁平直；下表皮細胞較窄長，排列不規(guī)則，垂周壁微波狀起伏。桑葉上、下表皮都有表皮毛、腺毛等附屬物分布。在上下表皮中都有鐘乳體細胞，但上表皮分布相對較多，表皮毛細胞中也有鐘乳體的存在。氣孔器分布特征在桑屬內(nèi)比較穩(wěn)定，均為下表皮具有氣孔器，氣孔類型屬于無規(guī)則型。柵欄組織細胞的排列相對緊密且規(guī)則，而海綿組織細胞排列松散且不規(guī)則，葉肉細胞中還有大量的晶體分布。這些種間比較多的相似的特征說明桑屬植物是1個自然的分類群，把這些植物歸入到1個屬中有一定的科學性和合理性。

3.2 桑屬植物氣孔器特征的分類學意義

通過光學顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，桑屬植物葉表皮特征有很多相似性，但在氣孔器形態(tài)、氣孔面積、氣孔密度等特征上存在一定的差異。因此，依據(jù)不同特征可以獲得不同的分類群，根據(jù)氣孔面積可以把各桑種分為3類：華桑、廣東桑、長穗桑氣孔面積（均大于100 μm2）歸為一類；雞桑、白桑、蒙桑氣孔面積（介于80～100 μm2）歸為一類；川桑、山桑（均小于 80 μm2）為一類。根據(jù)氣孔器形態(tài)可以把各桑種分為圓形、橢圓形2類：白桑、廣東桑、長穗桑歸為一類；雞桑、華桑、蒙桑、川桑、山桑為一類。按照傳統(tǒng)的分類，白桑、廣東桑、長穗桑、華桑屬于無花柱類，應歸為一類，這與傳統(tǒng)分類出現(xiàn)一定的差異。研究結(jié)果中氣孔面積最大的種為華桑，最小的為川桑，氣孔密度最大的種是長穗桑，最小的種是蒙桑，說明桑屬植物種間氣孔器的特征差異是明顯的，可以作為該屬植物種間鑒定的重要指標。

3.3桑屬植物表皮毛特征的分類學意義

利用光學顯微鏡對表皮毛進行觀察，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，表皮毛形態(tài)各異，種間差異明顯。根據(jù)表皮毛的形態(tài)特征規(guī)律，將桑種分為3類：（1）長穗桑、蒙桑相似，無表皮毛分布；（2）川桑、白桑、山桑、廣東桑表皮毛疏生、較短，基部膨大，先端尾尖，整個毛呈漏斗狀、彎刀狀或三角形等；（3）雞桑、華桑表皮毛密生、較長，柔軟，基部膨大不顯著，先端有彎曲。從葉表皮毛的顯微特征推測：桑屬植物演化水平由低到高依次為長穗桑、蒙桑→川桑、白桑、山桑、廣東桑→雞桑、華桑。

3.4桑屬植物葉表皮研究的爭論

迄今為止，關(guān)于葉表皮及氣孔器特征在其他屬植物分類中已廣泛應用，但在桑屬植物內(nèi)研究較少。關(guān)博夫等曾對桑葉氣孔的形態(tài)進行觀察，發(fā)現(xiàn)氣孔大小、數(shù)量等特征在桑樹品種間有差異[11-12]，本研究與其結(jié)果基本相似。勝又藤夫曾把桑巨大細胞的形態(tài)及突起的長度作為分類的依據(jù)，將桑樹分為4個類型。由于本試驗的取材有限，沒有發(fā)現(xiàn)桑屬植物鐘乳體細胞形態(tài)的顯著差異，還有待于進一步的研究。劉云等運用光學顯微鏡和掃描鏡對11種蠶用桑品種的葉表皮形態(tài)和結(jié)構(gòu)進行觀察研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)品種間在表皮、葉肉和葉脈上的構(gòu)造基本相似，主要的差別在于氣孔密度、上表皮細胞中的鐘乳體細胞數(shù)量[13]。

背密被白色柔毛；廣東桑葉背面無毛，葉脈疏生白色柔毛；雞桑葉面密生短刺毛，背面疏被粗毛；華桑葉面粗糙有毛，葉背密生柔毛。本研究觀察結(jié)果與傳統(tǒng)的形態(tài)描述基本一致。本研究結(jié)果進一步驗證了這些結(jié)論的正確性，同時還發(fā)現(xiàn)表皮毛特征對于桑屬植物種間鑒定具有非常顯著的意義。

徐淑紅等認為，毛狀體的種類具有一定的穩(wěn)定性，不會隨著植物分布區(qū)域的不同而發(fā)生變化，但可以隨生境的不同在其數(shù)目上有所改變，應用毛狀體的類型和其他相關(guān)性狀可以對植物進行鑒定[22]，本研究結(jié)果再次驗證了毛狀體特征可以對植物進行分類鑒定。

4結(jié)論

桑屬植物葉表皮及葉肉性狀具有一定相似性。氣孔器形狀、氣孔面積、氣孔密度、鐘乳體細胞形狀、鐘乳體細胞數(shù)量、表皮毛形態(tài)等特征存在種間差異，根據(jù)氣孔面積把桑屬分為3類，依據(jù)氣孔器形態(tài)可以把桑屬分為2類，依據(jù)表皮毛特征可以分為三大類，桑屬植物葉表皮特征作為該屬種間鑒定的指標是可行的，但是依據(jù)某個單一的形態(tài)特征形狀，并不能將各個種之間完全區(qū)分開，因此應該綜合多種形態(tài)性狀進行分析。

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