超聲波輔助提取癩葡萄總黃酮工藝的優化

袁曉晴　李磊　劉紅梅

摘要：為優化癩葡萄中總黃酮的超聲波輔助提取工藝，通過單因素試驗確定乙醇體積分數、液固比、提取時間、提取溫度、超聲功率5個提取工藝參數的最適水平范圍，并通過響應面分析法（RSM）對乙醇體積分數、提取溫度、提取時間進行優化。結果表明，超聲波輔助提取癩葡萄總黃酮的最佳工藝條件為：乙醇體積分數72%、提取溫度68 ℃、提取時間34 min，此條件下黃酮提取率為2.53%；驗證試驗表明，黃酮提取率為2.54%，與理論值相符合。

關鍵詞：癩葡萄；黃酮；超聲波輔助提??；響應面分析

中圖分類號： R284.2文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2015）11-0340-03

收稿日期：2015-01-08

基金項目：河南省科技攻關計劃（編號：142102110177）。

作者簡介：袁曉晴（1977—），女，江蘇泰州人，博士，副教授，主要從事農產品深加工研究。E-mail：yxq_yrd@163.com。癩葡萄（Momordica charantia L. var. abbreviata Ser.）別稱名金鈴子，是葫蘆科苦瓜屬（Momordica）的栽培種之一，其果實呈紡錘狀，果面呈不規則尖刺狀，長約4 cm、寬約3 cm、單果質量25～30 g，未成熟果實呈淺綠色，成熟后呈金黃色。目前關于癩葡萄中活性肽、皂苷的研究較多[1-2]，而對癩葡萄中黃酮的研究較少。癩葡萄的果實、葉中均富含黃酮，黃酮是一種強抗氧化劑，具有清除自由基、抗衰老、抗炎抑菌、降低膽固醇含量等多種生理功效[3-5]。

提取植物中總黃酮的傳統方法是熱回流提取法。近年來，隨著提取技術的不斷發展，許多學者使用超聲波輔助法分別從黃花菜[6]、馬齒莧[7]、苦蕎[8]等植物中提取總黃酮。超聲波提取是利用超聲波破碎細胞（空化）和強化傳質（機械）作用，使溶劑分子滲透到組織細胞中與溶質分子充分接觸，從而使細胞中的可溶成分更快釋放出來，該方法具有提取速度快、得率高、對熱不穩定物質破壞少等特點[9]。本研究通過單因素試驗、響應面分析法優化超聲波輔助提取癩葡萄總黃酮的工藝，以期為癩葡萄黃酮的開發利用提供依據。

1材料與方法

1.1材料與儀器

癩葡萄采自南京市郊區，于70 ℃下烘干，冷卻后粉碎過40目篩，置于干燥器中保存備用。蕓香苷購自中國醫藥（集團）上?；瘜W試劑公司；無水乙醇（AR）、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉均為分析純。

XA-1型高速萬能粉碎機（江蘇省姜堰市銀河實驗儀器廠產品），WFJ7200型可見分光光度計（上海尤尼柯儀器有限公司產品），KQ-200VDE型雙頻數控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司產品），SHZ-D型循環水式真空泵（鄭州市長城科工貿有限公司產品）。

1.2試驗方法

1.2.1標準曲線的制作精確稱取蕓香苷標準品0.01 g，用70%乙醇溶解并定容至100 mL，得到濃度為0.1 mg/mL的標準溶液。分別準確吸取蕓香苷標準溶液0.0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mL于10 mL容量瓶中，加入0.5 mL質量分數為5%的NaNO2溶液，搖勻并靜置6 min，加入0.5 mL質量分數為10%的Al（NO3）3溶液，搖勻并靜置6 min，再加入 4.0 mL 質量分數為4%的NaOH溶液，最后添加70%乙醇至刻度，搖勻并靜置15 min，于波長510 nm處測定吸光度，到得蕓香苷濃度C（mg/mL）與吸光度D之間的回歸方程：

C=0.085 3D+0.002 5，r2 =0.998 8。

1.2.2癩葡萄總黃酮的提取及測定精確稱取脫脂后的癩葡萄粉1.0 g，加入一定體積分數的乙醇溶液，按相應條件進行超聲波輔助提取，減壓抽濾并將濾液移至燒杯中待測。吸取1.0 mL待測液于10 mL容量瓶中，按照“1.2.1”節的方法測定黃酮質量，黃酮提取率的計算公式為：

黃酮提取率=C×10×Vm×100%。

式中：C為總黃酮濃度（mg/mL）；m為癩葡萄粉質量（mg）；V為癩葡萄提取液體積（mL）。

1.2.3單因素試驗分別考察乙醇體積分數、液固比、提取溫度、提取時間、超聲功率對癩葡萄黃酮提取率的影響。試驗中各考察因素的設定水平分別為：乙醇體積分數50%、60%、70%、80%、90%；液固比（mL ∶g）10 ∶1、20 ∶1、30 ∶1、40 ∶1、50 ∶1；提取溫度40、50、60、70、80、90 ℃；提取時間10、20、30、40、50 min；超聲功率120、140、160、180、200 W。除考察因素外，其他因素的條件為：乙醇體積分數70%、液固比30 mL ∶1 g、超聲功率180 W、提取溫度70 ℃、提取時間30 min。

1.2.4響應面優化試驗在單因素試驗的基礎上，以乙醇體積分數、提取溫度、提取時間為因素，采用Design-Expert軟件的中心組合試驗Box-Behnken設計3因素3水平（表1）的中心旋轉組合試驗。

2結果與分析

2.1單因素試驗結果

2.1.1乙醇體積分數的影響當乙醇體積分數低于70%

時，癩葡萄黃酮提取率隨乙醇體積分數的提高逐漸增大；當乙醇體積分數高于70%時，黃酮提取率反而下降（圖1）?？梢?，乙醇體積分數為70%左右時，溶劑與溶質極性最相似；乙醇體積分數過高則葉綠素等脂溶性物質的溶出量增多，不利于黃酮的提純[10]，因此確定乙醇體積分數為70%。

2.1.2液固比的影響當液固比小于30 mL ∶1 g時，癩葡萄黃酮提取率隨液固比的增加顯著提高；當液固比大于 30 mL ∶1 g 時，黃酮提取率的增幅降低（圖2）。液固比過高將增加溶劑成本，并加重后續的濃縮和干燥工作，因此確定液固比為30 mL ∶1 g。

2.1.3提取時間的影響在提取的前30 min內，癩葡萄黃酮提取率隨提取時間的延長顯著提高；當提取時間繼續延長時，黃酮提取率的增幅降低（圖3）。為提高工作效率，確定提取時間為30 min。

2.1.4提取溫度的影響當溫度低于70 ℃時，癩葡萄黃酮提取率隨溫度的升高顯著增大；當溫度高于70 ℃時，黃酮提取率反而降低（圖4）。溫度升高會加劇溶劑和溶質分子運動，有利于黃酮浸出；而溫度過高會增加其他物質的溶出，并可能破壞黃酮活性成分，因此確定提取溫度為70 ℃。

2.1.5超聲功率的影響當超聲功率低于180 W時，癩葡萄黃酮提取率隨超聲功率的增加而增大；當超聲功率高于180 W時，黃酮提取率反而下降（圖5）。超聲功率增大則空化作用大，總黃酮傳質速率高；超聲功率過高會使分子運動加劇、溶劑溫度升高，從而破壞黃酮組分并增加其他雜質的溶出[11]，使癩葡萄黃酮提取率降低，因此確定超聲功率為180 W。

2.2響應面優化提取工藝條件

2.2.1響應面試驗設計與結果確定超聲功率、液固比后，以乙醇體積分數（X1）、提取溫度（X2）、提取時間（X3）為變量，開展3因素3水平的響應面試驗。本次提取工藝優化試驗采取中心旋轉組合設計，試驗設計和結果見表2。

2.2.2回歸模型的建立及方差分析以黃酮提取率為響應值，經回歸擬合，各試驗因子對響應值的影響可用回歸方程表示：

Y=2.450+0.024X1+0.055X2+0.056X3-0.15X12-0.20X22-0.18X32+0.095X1X2-0.083X1X3-0.005X2X3。

對該回歸方程進行方差分析及顯著性評價（表3），此模型的P<0.000 1，表明響應面回歸模型達到極顯著水平；失擬項P值大于0.05，呈不顯著，表明該方程擬合3個參數與黃酮提取率之間的關系是可行的；較高的R2值（0.998 6）進一步表明，試驗方程式與實際數據之間具有非常好的擬合性。

回歸方程系數的顯著性分析表明，乙醇體積分數、提取溫度、提取時間均對黃酮提取率具有顯著性影響（P<0.001），影響效果大小依次為：提取時間>提取溫度>乙醇體積分數。這3個因素的二次項X12、X22、X33對黃酮提取率也有顯著性

影響（P<0.001）。

顯著（P<0.001），表明乙醇體積分數與提取溫度、乙醇體積分數與提取時間的交互作用對黃酮提取率的影響極顯著；X2X3項的回歸系數不顯著（P= 0.197 3），表明提取溫度與提取時間的交互作用對黃酮提取率的影響不顯著。

提取條件對癩葡萄黃酮提取率影響的響應面見圖6，其作用均為上凸曲面，表明本試驗所選擇的區域范圍合理。隨著乙醇體積分數、提取溫度、提取時間的增大，黃酮提取率均呈先升高、后下降的變化趨勢，表明乙醇體積分數、提取溫度、提取時間對黃酮提取率的影響效果明顯。通過分析計算得到最佳提取條件： 乙醇體積分數72%、 提取溫度68 ℃、 提取時間34 min，此條件下黃酮提取率的理論值為2.53%。

為檢驗響應面分析法的可靠性，采用上述優化參數進行提取試驗，實際測得癩葡萄黃酮提取率為2.54%，與理論預測值的相對誤差為0.4%，表明采用響應面分析法優化得到的提取工藝參數準確可靠，具有實用價值。

3結論

為探討超聲波輔助提取癩葡萄總黃酮的工藝條件，首先通過單因素試驗確定乙醇體積分數、液固比、提取時間、提取表3回歸模型方差分析及顯著性檢驗

溫度、超聲功率的最適水平范圍，再通過響應面分析法對乙醇體積分數、提取溫度、提取時間進行優化。結果表明，超聲波輔助提取癩葡萄總黃酮的最佳工藝條件為：乙醇體積分數72%、提取溫度 68 ℃、提取時間34 min，此條件下的黃酮提取率為253%。驗證試驗表明，黃酮提取率為2.54%，與理論值相符合。

參考文獻：

[1]Yuan X Q，Gu X H，Tang J. Purification and characterrization of a hypoglycemic peptide from Momordica charantia L. var. abbreviata Ser.[J]. Food Chemistry，2008，111：415-420.

[2]趙海雯，湯堅. 癩葡萄皂甙的降糖功效探索[J]. 食品科技，2007（12）：224-227.

[3]延璽，劉會青，鄒永青，等. 黃酮類化合物生理活性及合成研究進展[J]. 有機化學，2008，28（9）：1534-1544.

[4]Zhou P，Li L P，Luo S Q，et al. Intestinal absorption of luteolin from peanut hull extract is more efficient than that from individual pure luteolin[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry，2008，56（1）：296-300.

[5]Sousa F，Guebitz G M，Kokol V. Antimicrobial and antioxidant properties of chitosan enzymatically functionalized with flavonoids[J]. Process Biochemistry，2009，44（7）：749-756.

[6]高中松. 超聲波提取黃花菜中總黃酮的工藝研究[J]. 中國林副特產，2006，82（3）：15-16.

[7]秦學會，阮美娟，趙龍，等. 響應面法優化超聲波水提馬齒莧黃酮的工藝[J]. 天津科技大學學報，2009，24（1）：19-21，25.

[8]羅倉學，張冬梅，胡兵，等. 響應曲面法優化超聲波輔助提取苦蕎總黃酮研究[J]. 糧食與油脂，2011（8）：17-21.

[9]Zhang Q A，Zhang Z Q，Yue X F，et al. Response surface optimization of ultrasound-assisted oil extraction from autoclaved almond powder[J]. Food Chemistry，2009，116（2）：513-518.

[10]華景清，蔡健. 苦瓜總黃酮提取工藝[J]. 食品與發酵工業，2004，30（6）：131-134.

[11]董發明，白喜婷. 響應面法優化超聲提取杜仲雄花中黃酮類化合物的工藝參數[J]. 食品科學，2008，29（8）：227-231.董玉蘭，李書生，張麗萍，等. 生物型保鮮紙對中華壽桃的保鮮效果[J]. 江蘇農業科學，2015，43（11

：343-345.