楓香樹葉黑色素粗產品提取工藝的優化

謝宇奇　零學仕　周作樹等

摘要：以楓香樹葉為原料提取黑色素粗產品。在單因素試驗的基礎上應用Box-Behnken中心組合設計建立數學模型，以提取得率作為響應值，對提取劑濃度、料液比、提取時間等3個主要影響因素進行響應面法分析，得到楓香樹葉黑色素提取的優化工藝條件。結果表明，3個因素對楓葉黑色素提取得率影響由大到小依次為料液比、乙醇濃度、提取時間，最優提取工藝參數為乙醇濃度40%、料液比1 g ∶40 mL、最佳提取時間4 h，此條件下初步干燥的楓香樹葉黑色素粗產品的提取得率為41.47%。

關鍵詞：楓香樹葉；黑色素；優化；提取工藝；工藝參數；響應面分析法

中圖分類號： R284.2文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2015）11-0348-04

收稿日期：2014-10-24

基金項目：廣西高校科學技術研究項目（編號：LX2014441）。

作者簡介：謝宇奇（1979—），男，壯族，廣西靖西人，碩士，高級實驗師，主要從事天然產物化學及化學分析研究。E-mail：xiekey@sina.com。黑色素是廣泛存在于動植物和微生物界的保護性色素[1-2]。天然黑色素具有抗病毒、抗輻射和提高免疫力等多種功效，能抑制艾滋病毒復制[3]、解蛇毒[4]，還能治療治療老年性癡呆癥、帕金森癥等與黑色素缺乏相關的神經系統疾病[5]。天然黑色素雖然存在較為廣泛，但是由于染色工序相對復雜，染色效果不穩定、生產成本高等原因，違規添加人工合成色素，制造有毒“黑色”食品的現象時有發生，存在致病安全隱患。從不同來源提取天然黑色素已經成為研究熱點。人們已成功從黑米[6]、黑木耳[7]、花椒籽[8]等天然食品中提取出黑色素。楓香樹（Liquidambar formosana Hance）葉中含有豐富的花色苷類黑色素，具有有祛風濕、行氣、解毒等功效[9]，常用于治療瘡癤腫痛及外傷出血等癥[10-11]，在藥用研究方面有重要開發價值[12-13]。我國壯族、黎族等少數民族利用楓香樹葉黑色素染制黑色糯米飯有著悠久的歷史，其安全性和藥用功效得到了長期檢驗，是制取天然黑色素的理想原料。目前，楓香樹葉黑色素的提取工藝鮮見報道[14-16]。本試驗以楓香樹葉為原料，采用響應面分析法優化提取工藝，從而為楓香樹葉黑色素的開發利用提供參考數據。

1材料與方法

1.1試驗材料

1.1.1試驗材料和試劑楓香樹葉樣品：采集于廣西壯族自治區百色市右江區，洗凈后經60 ℃干燥，粉碎備用；無水乙醇、石油醚、鹽酸、乙酸乙酯、丙酮等藥品均為國產AR級。

1.1.2儀器與設備UA-2700型分光光度計（日本島津公司）；TGL-16M高速冷凍離心機（湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司）；SHB-Ⅲ循環水式多用真空泵（河南鄭州市世紀雙科實驗儀器有限公司）。

1.2試驗方法

1.2.1楓香樹葉黑色素提取工藝流程提取工藝流程：新鮮葉片→洗凈后干燥→粉碎→稱質量→浸漬提取→分離，收集濾液→以60 ℃烘干→黑色素粗產品。

黑色素提取得率計算：得率y=黑色素粗產品質量/楓香樹葉粉末質量×100%。

1.2.2提取劑的選擇準確稱取相同質量的楓香樹葉樣品5份，按1 g ∶30 mL的料液比分別加入蒸餾水、乙醇、乙酸乙酯、石油醚、丙酮等提取劑，調節pH值<3.5，在相同水浴中浸漬提取1 h。以3 000 r/min的轉速離心分離，準確移取相同體積提取液，用相應提取劑稀釋定容到相同容積容量瓶，并以相應提取劑為參比，分別測210 nm處的吸光度。

1.2.3測定波長的選擇取楓香樹葉的乙醇提取液，稀釋到適合紫外-可見分光光度計工作的濃度后，在200～400 nm范圍內進行紫外光譜掃描，繪制吸光圖，從圖中選取最大吸收波長為本試驗測定波長。

1.2.4提取溫度的選擇稱取5份1.00 g 楓香樹葉樣品置于100 mL錐形瓶中，按料液比為1 g ∶30 mL加入提取劑，調節pH<3.5，密封后分別在 40、50、60、70 ℃的水浴中恒溫浸提1 h。離心沉淀，取上層提取液，分別準確移取25 μL上清液，并用相應的提取劑定容至25.00 mL，以相應的提取劑為參比，測210 nm波長的吸光度。

1.2.5楓香樹葉黑色素提取的單因素研究

1.2.5.1提取劑濃度的影響稱取5份楓香樹葉樣品1.00 g，置于100 mL錐形瓶中，分別按料液比1 g ∶30 mL加入20%、40%、50%、60%、80%的乙醇溶液，調節pH值<35，密封后在60 ℃恒溫水浴中提取1 h。離心沉淀，分別移取25 μL上清液，并分別用相應的提取劑定容至25.00 mL。以相應的提取劑為參比，測210 nm波長處的吸光度。

1.2.5.2料液比的影響稱取5份楓香樹葉樣品1.00 g，置于100 mL錐形瓶中，分別按分別按料液比為 1 ∶10、1 ∶20、1 ∶30、1 ∶40、1 ∶50（g ∶mL）加入同濃度提取劑，調節 pH值<3.5，密封后在60 ℃恒溫水浴中提取1 h。抽濾收集濾液，在恒溫干燥箱中用60 ℃烘至恒重，后計算成品得率。

1.2.5.3提取時間的影響稱取8份楓香樹葉樣品1.00 g，置于100 mL錐形瓶中，按1 g ∶30 mL的料液比加入提取劑，調節pH值<3.5，在 60 ℃的恒溫水浴中分別浸提 0.5、1、2、3、4、5、6、7 h。離心沉淀后，分別移取25 μL提取液，用相應的提取劑定容至25.00 mL。以相應的溶劑為參比，測210 nm波長處的吸光度。

1.2.6響應面法優化楓葉黑色素的提取工藝選取3因素3水平的響應面分析方法，因素水平編碼見表1。

2結果與分析

2.1楓香樹葉黑色素提取劑的選擇

各種提取劑的試驗結果如表2所示，由表2可知乙醇溶液的提取效率最高，本試驗選取乙醇作為楓香樹葉黑色素的提取劑。

2.2楓香樹葉黑色素最大吸收波長的選擇

楓香樹葉黑色素的乙醇提取液在200～400 nm范圍內的光吸收情況如圖1所示。

由圖1可知，在200～400 nm范圍內，楓香樹葉黑色素乙醇提取液的吸光度先隨著波長增大而升高，在波長為210 nm左右時，其吸光度達到最大峰值，之后不斷下降，故本試驗選取210 nm為楓香樹葉黑色素的測定波長。

2.3楓葉黑色素提取溫度的選擇

如表3所示，在40～70 ℃范圍內，提取效率隨著溫度提高而上升。試驗發現，隨著提取溫度增高，提取劑揮發損失也會增大，越接近乙醇沸點越明顯。綜合考慮提取效率和提取成本，本試驗選擇60 ℃作為楓香樹葉黑色素的提取溫度。

2.4單因素試驗結果

2.4.1乙醇濃度對楓香樹葉黑色素提取效率的影響由圖2可知，在20%～50%的乙醇濃度范圍內，楓香樹葉黑色素的提取效率隨濃度提升，50%乙醇濃度時達到最大，之后再提高乙醇濃度，吸光度反而下降。因此選擇50%左右的乙醇作為提取劑是較為適宜的。

2.4.2料液比對楓葉黑色素提取工藝的影響料液比直接影響黑色素在固液兩相的濃度差。提高料液比，可以降低黑色素在溶劑中的濃度，進而有利于楓香樹葉中尚未溶解的黑色素繼續向溶劑擴散。但當料液比大到一定程度，楓香樹葉中的黑色素基本溶出，再提高料液比，不僅不能提高提取得率，還會增加溶劑使用量，增加雜質溶出的概率，并增加溶劑蒸發等后續工藝的難度，進而提高提取工藝的成本。由圖3可知，當料液比為1 g ∶30 mL～1 g ∶40 mL時，黑色素的得率處于較高水平，因此選擇料液比為1 g ∶30 mL～1 g ∶40 mL為宜。

2.4.3提取時間對楓葉黑色素提取工藝的影響由圖4可知，在0.5～4 h之間時，提取液的吸光度隨著提取時間的延長而增大，當達4 h后，吸光度進入一個平臺，直到7 h后，才略有上升。綜合考慮提取工藝能耗等成本，本試驗提取時間在4～6 h為宜。

2.5響應面分析結果

2.5.1響應面分析試驗設計方案對楓香樹葉黑色素的提取工藝進行響應面分析試驗。以乙醇濃度x1、料液比x2、提取時間x3為自變量，以楓香樹葉黑色素粗產品提取得率y為響應值。Box-Behnken分析方案及試驗結果見表3。

2.5.2回歸方程和方差分析用Design-Expert 8.0.5b軟件程序對試驗數據進行回歸分析，得出楓葉黑色素提取得率

由表4可分析出，用以上回歸方程描述楓香樹葉黑色素提取工藝中各因素與響應值之間的關系時，因變量和全體自變量之間的線性關系顯著，相關系數R2為98.32，模型的顯著水平遠遠小于0.05，此Quadratic回歸方差模型為高度顯著。

由表4的分析可知，楓葉黑色素提取工藝中各個因素影響得率從大到小的順序依次為料液比（x2）、乙醇濃度（x1）和提取時間（x3），其中料液比對楓葉黑色素提取得率的影響最為顯著。

2.5.3響應面圖分析由圖5、圖6、圖7可知，楓香樹葉黑色素的提取工藝中，料液比（x2）的影響最為顯著，提取時間（x3）和提取劑乙醇濃度（x1）次之。

利用Design-Expert 8.0.5b軟件程序對楓葉黑色素的提取工藝條件進行優化，可得最佳方案為乙醇濃度（x1）40%、料液比（x2）為1 g ∶40 mL、提取時間（x3）4 h。在此提取工藝條件下，初步干燥的楓葉黑色素粗產品的提取得率預測值為41.73%。

2.5.4模型的驗證性試驗固定乙醇濃度為40%、料液比為1 g ∶40 mL、提取時間4 h，平行提取3次，得到未除雜、60 ℃烘干后的楓香樹葉黑色素粗產品，平均提取率為41.47%。試驗值與模型理論預測值基本一致，說明優化方案是可行的。

3結論

經響應面法分析，影響楓香樹葉黑色素粗產品提取率的主要因素的影響大小依次為料液比，乙醇濃度，提取時間。楓香樹葉最優提取工藝參數為乙醇濃度為40%，料液比1 g ∶40 mL、最佳提取時間4 h。黑色素粗產品經60 ℃烘干后的實際提取得率為41.47%，形態為黑色塊狀固體。本研究為楓香樹葉黑色素的綜合開發應用提供了參考。

參考文獻：

[1]Brown D A. Skin pigmentation enhancers[J]. Journal of Photochemistry and Photobiology B-Biology，2001，63（1/2/3）：148-161.

[2]Hill H Z. The function of melanin or six blind People examine an elephant[J]. BioEssays，1992，14（1）：49-56.

[3]胡國斌，鄭從義，屈三甫，等. 黑色素抑制流感病毒誘導宿主細胞凋亡[J]. 中國病毒學，1999，14（2）：140-146.

[4]Hung Y C，Sava V，Hong M Y，et al. Inhibitory effects on phospholipase A2 and antivenin activity of melanin extracted from Thea sinensis Linn[J]. Life Sciences，2004，74（16）：2037-2047.

[5]El-Obeid A，Al-Harbi S，Al-Jomah N，et al. Herbal melanin modulates tumor necrosis factor alpha （TNF-alpha），interleukin 6 （IL-6） and vascular endothelial growth factor （VEGF） production[J]. Phytomedicine：International Journal of Phytotherapy and Phytopharmacology，2006，13（5）：324-333.

[6]袁博，曹熙敏. 黑米黑色素提取的多元回歸統計模型[J]. 湖北農業科學，2013，52（14）：3375-3377.

[7]鄒宇，尹冬梅，胡文忠，等. 黑木耳天然黑色素理化性質及其抗氧化活性的研究[J]. 食品工業科技，2013，34（5）：118-120，125.

[8]徐文秀，王曉燕，王鵬，等. 花椒籽中黑色素提取工藝的優化研究[J]. 食品工業科技，2013，34（3）：265-268.

[9]謝躍生，鄭小軍，鄭麗蓉，等. 楓香樹葉中某些水溶性微量元素的分析[J]. 廣西師院學報：自然科學版，2000，17（3）：5-7.

[10]中國醫學科學院陜西分院中醫研究所.陜西中藥志：第一卷[M]. 西安：陜西人民出版社，1962.

[11]國家藥典委員會.中國藥典：一部[M]. 北京：化學工業出版社，2005.

[12]賈敏如，李星煒. 中國民族藥志要[M]. 北京：中國醫藥科技出版社，2005.

[13]翁琳琳，蔣家淡，張鼎華，等. 鄉土樹種楓香的研究現狀與發展前景[J]. 福建林業科技，2007，34（2）：184-189.

[14]陳祖洪. 從楓香樹葉中提取黑色素的探索[J]. 林產化工通訊，1998（1）：20-21.

[15]辜燕飛，黃瀾，何猛雄，等. 海南楓香傳統食用黑色素的初步研究[J]. 食品工業科技，2007，28（8）：86-87.

[16]姜平川. 楓葉黑色素理化性質研究[J]. 食品工業科技，1998，19（4）：8-10.廖文艷，徐致遠，劉振民. 1種低乳糖褐色乳酸菌飲品的研究[J]. 江蘇農業科學，2015，43（11

：352-354.