L—半胱氨酸及金屬離子對馬鈴薯、蘋果、甘薯多酚氧化酶活性的影響

廖春麗　王衡　李亞平等

摘要：以馬鈴薯、蘋果和甘薯為研究對象，研究L-半胱氨酸和金屬離子對上述3種作物多酚氧化酶（PPO）活性的影響。結果表明，L-半胱氨酸對馬鈴薯、蘋果和甘薯PPO活性抑制作用明顯，隨著L-半胱氨酸濃度增大，酶活性降低幅度越大，作用于馬鈴薯、蘋果的IC50（導致酶活性下降50% 的抑制劑濃度）為0.05 mmol/L，甘薯為0.10 mmol/L。0.20 mmol/L L-半胱氨酸，使馬鈴薯、蘋果和甘薯中PPO活性抑制率在90%以上，隨著時間的延長，最大抑制率變化不大。無論是馬鈴薯、蘋果還是甘薯，Mn2+和 Fe3+對它們的PPO活性有不同程度的激活作用，而Ca2+、Na+和Cu2+對PPO活性有一定的抑制作用。抑制作用最強的是Cu2+，3.0 mmoL/L Cu2+對馬鈴薯PPO活性抑制率為49.1%，對蘋果PPO活性抑制率為60.8%，對甘薯PPO活性抑制率為69.7%。

關鍵詞：馬鈴薯；蘋果；甘薯；多酚氧化酶；L-半胱氨酸；金屬離子

中圖分類號： TS201.2+5文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2015）11-0375-03

收稿日期：2014-11-12

基金項目：河南省教育廳項目（編號：12B180002）。

作者簡介：廖春麗（1980—），女，河南信陽人，碩士，講師，從事微生物發酵研究。Tel：（0375）2089072；E-mail：liao20130427@163.com。多酚氧化酶（PPO） 是廣泛存在于生物體內的含銅氧化還原酶，它包括單酚氧化酶、雙酚氧化酶和漆酶[1]。它在動植物體酶促褐變、體內色素合成的過程中起了關鍵作用[2]，更是果蔬酶促褐變過程中起重要作用的一種酶[3-4]。它能將酪氨酸羥化，產生3，4-二羥基苯丙氨酸（L-多巴），然后再將多巴氧化成多巴醌，多巴醌自發集合且和細胞內蛋白質的一些氨基酸基團發生反應，產生黑色和褐色的物質，導致組織酶促褐變[5]，因此PPO 是引起褐變的關鍵酶。褐變問題一直是很多果蔬收獲后保藏、加工等過程中導致質量下降，經濟價值降低的一個非常重要的問題，因此研究防止褐變的PPO抑制劑是農產品加工需要解決的主要問題。L-半胱氨酸（L-半胱氨酸）作為一種高效安全的PPO抑制劑，在食品保鮮中的應用已有研究[6]。本研究以馬鈴薯、蘋果和甘薯為研究對象，探討L-半胱氨酸和金屬離子對馬鈴薯、蘋果和甘薯PPO 活性的調控，為防止果蔬貯運加工過程中褐變提供理論基礎。

1材料與方法

1.1材料

無花號馬鈴薯、紅富士蘋果、甘薯（市售）。

1.2方法

1.2.1PPO的分離純化將在4 ℃冰箱中預冷的馬鈴薯、蘋果、甘薯洗凈后去皮，分別切塊，稱取100 g加入300 mL冷凍丙酮（-20 ℃），勻漿2 min，然后抽濾，濾餅再用冷凍丙酮提取，反復3次抽濾至無色，繼續抽干至無丙酮味，即制得馬鈴薯丙酮干粉。制得干粉置于冰箱中于-20 ℃冷凍保存，使用時分別稱取5 g干粉，以1 g ∶8 mL的比例溶于在4 ℃冰箱中預冷的0.2 mol/L磷酸緩沖溶液（pH值6.8）中，攪拌10 min（整個試驗操作都在冰上進行），然后用冷凍離心機（4 ℃）于15 000 r/min離心 15 min，吸取上清液，即得3種作物的PPO粗酶液[7]。粗酶液進一步用40%飽和度硫酸銨鹽析（緩慢加入并攪拌，直至完全溶解），然后用冷凍離心機（4 ℃）于 6 000 r/min 離心20 min，棄除沉淀，向收集到的上清液中加入70%飽和度硫酸銨（緩慢加入并攪拌，直至完全溶解），最后在冷凍離心機（4 ℃）中，于 6 000 r/min 離心 20 min，收集沉淀，沉淀用4 ℃預冷的PBS溶解，得純化的PPO酶液。

1.2.2PPO活性的測定參照Franceso等的方法[8-9]，作部分修改。總反應體系9.5 mL，在6 mL 0.2 mol/L磷酸緩沖液（pH值6.8）的反應體系中，加入1 mL 0.1 mol/L的鄰苯二酚溶液為底物，置于30 ℃恒溫水浴鍋中保溫10 min，再加入0.5 mL純化的PPO酶液和不同量的L-半胱氨酸，30 ℃間隔1 min在475 mn波長下測定吸光度D475 nm，測定5次，每次重復3次。以不加L-半胱氨酸為對照，各處理取4 mL樣品提取液進行比色。

1.2.3PPO活性的計算本試驗以鄰苯二酚為底物，在PPO催化下生成有色產物。其顯色物質在475 nm處有最大吸收，吸光度在單位時間內的變化和單位酶活性成正比。制作D475 nm隨時間變化的曲線，根據曲線的初始線性部分計算1 min 吸光度變化值ΔD475 nm，然后以1 g鮮質量果蔬樣品1 min 吸光度變化值增加1時為1個PPO活性單位（U）[10] ，相關公式為：

PPO活性= ΔD475 nm×VΔt×Vs×m。

式中：ΔD475 nm為反應混合液的吸光度變化值；Δt為酶促反應時間，min；V為樣品提取液總體積，mL；Vs為測定時所取樣品提取液體積，mL；m為樣品質量，g。

1.2.4金屬離子對酶活性的影響為了測定金屬離子對PPO的影響，按表1所示組成反應體系，按“1.2.2”節方法測定PPO活性，按“1.2.3”節方法計算PPO活性，最后按下面公式計算PPO相對活性：

PPO相對活性=測定組PPO活性-對照組PPO活性對照組PPO活性×100%。

2結果與分析

2.1L-半胱氨酸對馬鈴薯PPO活性的影響

L-半胱氨酸對馬鈴薯中PPO活性的抑制作用也非常強，隨著濃度越大，酶活性降低越多（圖1）：當添加 0.05 mmol/L

2.2L-半胱氨酸對蘋果PPO活性的影響

從圖2中看出，L-半胱氨酸對蘋果中的PPO活性有明顯的抑制作用，隨著濃度越大，酶活性降低越多：當添加 0.10 mmol/L L-半胱氨酸，1 min時蘋果中PPO活性抑制率為50%；當L-半胱氨酸添加量為0.05 mmol/L，反應2 min，蘋果中PPO活性抑制率為50%；添加0.20 mmol/L L-半胱氨酸，蘋果中PPO活性抑制率為90%～97%，而且隨著時間的延長，最大抑制率變化不大。加入抑制劑之后PPO活性幾乎沒有增長，這說明L-半胱氨酸對PPO活性的抑制作用是屬于不可逆的。

2.3L-半胱氨酸對甘薯PPO活性的影響

甘薯是一種淀粉含量較高的蔬菜，洗凈去皮的甘薯在空氣中30 s內表面就能變黑，所以說甘薯中PPO活性非常高。由圖3可見，L-半胱氨酸對甘薯中PPO活性的抑制作用也非常強，濃度越大，酶活性降低越多：當添加0.10 mmol/L L-半胱氨酸，甘薯中PPO活性抑制率為50%；當添加0.20 mmol/L L-半胱氨酸，甘薯中PPO活性抑制率為 96%～97%。隨著時間的延長，最大抑制率變化不大。

2.4金屬離子對馬鈴薯、蘋果和甘薯PPO活性的影響

從表2可知，無論是馬鈴薯、蘋果還是甘薯，Mn2+和 Fe3+對它們的酶活性不僅沒有抑制，反而是激活作用，且隨著離子濃度的增加，激活越明顯。 Ca2+、Na+和Cu2+對酶活性有一定的抑制作用，其中對馬鈴薯、蘋果和甘薯PPO活性抑制作用最強的是Cu2+，隨著Cu2+濃度的增大，PPO的活性逐漸下降。在Cu2+濃度為3.0 mmoL/L時對馬鈴薯PPO活性抑制率達到49.1%，對蘋果PPO活性抑制率達到60.8%，對甘薯PPO活性抑制率達到69.7%。

3結論與討論

L-半胱氨酸的濃度在0.20 mmol/L以內對馬鈴薯、蘋果、甘薯3種蔬果中的PPO活性都產生抑制作用，而且隨著L-半胱氨酸濃度的升高，抑制作用也更加明顯，0.20 mmol/L L-半胱氨酸對3種蔬果中的PPO，活性有最大抑制作用，分別使甘薯、蘋果、馬鈴薯PPO的活性下降44.5%、39.1%、44.8%，也就是說L-半胱氨酸對3種蔬果的抑制作用表現為：馬鈴薯>甘薯>蘋果。

PPO屬于蛋白酶，其在發生作用時需要金屬離子的參與，金屬離子作為酶的輔基，是不可或缺的，能使酶行使正常的功能，所以在酶存在的環境中，人為地加入一些金屬離子，勢必會對PPO的活性造成影響，不同的金屬離子對PPO有不同的影響。因為Cl-、SO2-4 2種陰離子在一定的濃度范圍內，對PPO的活性沒有影響[11]，所以向反應體系中加入1 mL不同濃度的CaCl2、NaCl、CuSO4、MnCl2、FeCl3 溶液，對PPO的影響都是由于溶液中陽離子的影響。Cu2+的濃度在3.0 mmol/L以內對3種作物都有明顯的抑制作用，而且都是隨著Cu2+濃度的升高，對3種蔬果中的PPO的抑制作用也越來越明顯，3.0 mmol/LCu2+對馬鈴薯、蘋果、甘薯的PPO有最大的抑制作用，分別使馬鈴薯、蘋果、甘薯PPO活性下降49.1%、60.8%、69.7%。3種蔬果對Cu2+的敏感程度表現為：甘薯>蘋果>馬鈴薯。

在3.0 mmol/L的濃度以內，隨著Na+和Ca2+濃度的升高，3種作物中的PPO活性都表現為逐漸下降，但下降的幅度不大。Ca2+、Na+在3.0 mmol/L的濃度時，馬鈴薯PPO活性分別下降32.0%、36.7%，蘋果PPO活性分別下降30.9%、34.3%，甘薯PPO活性分別下降27.7%、29.7%；3種作物對Ca2+和Na+的敏感程度表現為：馬鈴薯>蘋果>甘薯。Fe3+和Mn2+在3 mmol/L的濃度以內對3種作物中的PPO有激活作用，兩者的激活作用表現為：Fe3+>Mn2+；3種作物對 Fe3+和Mn2+的敏感程度表現為：甘薯>蘋果>馬鈴薯。

參考文獻：

[1]陳清西，宋康康. 酪氨酸酶的研究進展[J]. 廈門大學學報：自然科學版，2006，45（5）：731-737.

[2]趙會全，劉望夷. 酪氨酸酶的分子生物學研究進展[J]. 國外醫學：分子生物學分冊，1991，13（6）：273-275，292.

[3]Sánchez-Ferrer A，Rodríguez-López J N，García-Cánovas F，et al. Tyrosinase：a comprehensive review of its mechanism[J]. Biochimica et Biophysica Acta，1995，1247（1）：1-11.

[4]韓濤，李麗萍. 果蔬多酚氧化酶的抑制及褐變的防治因素[J]. 北京農學院學報，1999，14（4）：88-93.

[5]Prota G. Progress in the chemistry of melanins and related metabolites[J]. Medicinal Research Reviews，1989，8（4）：525-556.

[6]Iyidogan N F，Bayindirh A. Effect of L-cysteine，kojic acid and 4-hexylresorcinol combination on inhibition of enzymatic browning in Amasya apple juice[J]. J Food Engineering，2004，62：299-304.

[7]王磊，阮征，駱成堯，等. 馬鈴薯多酚氧化酶酶學特性及熱穩定性模型的研究[J]. 食品工業科技，2012，33（19）：92-96.

[8]Franceso P. Inhibition of apple polyphenoloxidase（PPO） by ascorbic acid，citric acid and sodium chloride[J]. Journal of Food Processing and Preservation，1993，17（1）：21-30.

[9]Kouakou T H，Kouadio Y J，Kouamé P，et al. Purification and biochemical characterization of polyphenol oxidases from embryogenic and nonembryogenic cotton（Gossypium hirsutum L.） cells[J]. Applied Biochemistry and Biotechnology，2009，158（2）：285-301.

[10]黃紹華，胡曉波，王震宙，等. 山藥中多酚氧化酶的活性測定及其護色研究[J]. 食品與發酵工業，2005，13（6）：27-29.

[11]薛超彬，王勤，賀量，等. 金屬離子對菜青蟲酚氧化酶活性的影響[J]. 廈門大學學報：自然科學版，2005，44（增刊1）：120-122.盧春霞，劉長彬，唐宗貴，等. 三合激素在奶牛乳中的降解規律[J]. 江蘇農業科學，2015，43（11：378-379.