聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測南苜蓿SSR標記

陳祥++魏臻武++任海龍等

摘要：以南苜蓿（Medicago polymorpha）為試驗材料，用CTAB法提取南苜蓿基因組，選擇已開發的蒺藜苜蓿（Medicago truncatula）引物100對，分別在一年生苜蓿SSR-PCR反應體系和苜蓿屬變種SSR-PCR反應體系的基礎上進行PCR擴增，并將擴增產物進行8%的非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測，都得到了位點明顯、背景清晰的條帶。結果表明，南苜蓿均適合于現有的一年生苜蓿SSR-PCR反應體系和苜蓿屬變種SSR-PCR反應體系，建立了一套有效、成熟的應用于南苜蓿SSR標記的聚丙烯酰胺凝膠電泳銀染檢測的方法，該方法可以用于南苜蓿雜交F1代的鑒定以及后期資源的遺傳分析。

關鍵詞：南苜蓿；SSR標記；PAGE

中圖分類號： S540.1文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2015）11-0382-03

收稿日期：2014-11-10

基金項目：江蘇省科技支撐計劃（編號：BE2012340）；江蘇省普通高校研究生科研創新計劃（編號：CXLX_1429）。

作者簡介：陳祥（1990—），男，江蘇揚州人，碩士研究生，研究方向為牧草種質資源評價與遺傳育種。E-mail：yzdxchenxiang@163.com。

通信作者：魏臻武，博士，教授，主要從事牧草遺傳育種與種質資源評價研究。E-mail：zhenwu_wei@hotmail.com。南苜蓿（Medicago polymorpha）屬于豆科苜蓿屬，是一年生或越年生苜蓿，別稱秧草、草頭、金花菜[1-2]、多形苜蓿[3]等。南苜蓿多產于長江中下游地區，如江蘇、浙江等地，在安徽、江西、云南等地也有分布。南苜蓿常作為田間綠肥，也可作蔬菜和牧草。目前，隨著秧草保健功能的不斷彰顯，多地已經形成了以秧草為主的產業。南苜蓿實現了牧草功能的延伸，是長三角生態農業新的增長點，成為我國南方草業發展的新亮點[4]。

簡單序列重復（Simple sequence repeat，SSR），是重復序列的重要組成部分。SSR是由1～6個核苷酸為重復單位序列組成的串聯重復序列。SSR以PCR技術為基礎，并均勻分布于整個基因組中。由于SSR分子標記具有共顯性、涵蓋范圍廣、標記數量豐富、所揭示的多態性高等優點[5]，已經在分子育種、指紋圖譜構建、種子純度鑒定、基因定位等方面得到廣泛應用[6-7]。同樣，對于遺傳背景缺乏、沒有測序信息的植物，SSR仍然具有極高的利用價值。

聚丙烯酰胺凝膠電泳（Polyacrylamide gel electrophoresis，PAGE），是一種以聚丙烯酰胺凝膠作為介質的常用電泳技術。由于其檢測靈敏度和分辨率都比較高，是分子生物學和基因工程上不可缺少的試驗技術，特別適合SSR標記擴增產物的檢測[8-9]。本研究在張麗芳等模式植物蒺藜苜蓿（Medicago truncatula）SSR標記的PCR反應體系[10]和Eujayl 等苜蓿屬變種PCR反應體系[11]的基礎上，建立一種適用于南苜蓿SSR標記的聚丙烯酰胺凝膠電泳銀染檢測的方法。

1材料與方法

1.1試驗材料

本試驗所用的南苜蓿材料由揚州大學草業科學研究所野外搜集所得（表1），于2014年4月種植于揚州大學揚子津校區實驗地，在植株成型后取嫩葉研磨，提取的葉片DNA作為PCR反應的模板。試驗所用的MgCl2、dNTP、Taq聚合酶試劑均購自生工生物工程（上海）股份有限公司，其他常規試劑均為國產分析純。

1.2DNA提取

南苜蓿葉片基因組DNA提取采用魏臻武的CTAB法[12]。取10～15張葉片在液氮中迅速研磨成粉末，用于后續DNA的提取，提取的DNA經0.8%瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計檢測質量和濃度。樣品稀釋10倍放入4 ℃冰箱備用，原液放入-70 ℃冰箱長期保存。

1.3引物

引物來源于揚州大學草業科學研究所提供的100對蒺藜苜蓿SSR引物，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。引物粉末用超純水稀釋，保證引物的濃度高于10 μmol/L。待完全溶解后在漩渦混合器中混勻，離心，放入-20 ℃冰箱中保存待用。

1.4PCR反應體系和擴增程序

SSR反應體系[10]為10 μL（每孔添加量）。10 μL PCR體系含0.24 μL dNTP （10 μmol/L），3 μL Primer（10 μmol/uL），0.16 μL Taq polymerase（1 U），1.5 μL 10×buffer （1 μmol/L），3 μL DNA 模板（20～90 ng/μL），0.9 μL Mg2+（20 mmol/L），1.2 μL ddH2O。

一年生苜蓿PCR擴增程序[13]：94 ℃預變性3 min；95 ℃變性1 min，，55 ℃退火1.5 min （不同引物退火溫度不同），72 ℃延伸1min，共循環35次；最后72 ℃保溫8 min，4 ℃保存。

苜蓿屬變種PCR擴增程序[11]：95 ℃預變性10 min；95 ℃變性50 s，55 ℃退火50 s（不同引物退火溫度不同），72 ℃延伸90 s，共循環40次；最后72 ℃保溫10 min，4 ℃保存。

1.5PCR擴增產物的電泳檢測

PCR擴增產物中加入l L loading buffer （溴酚藍緩沖液），在8%非變性聚丙稀酰胺凝膠（PAGE）上，于100V電壓電泳0.5 h，200 V電壓電泳1 h，然后銀染檢測。

1.6圖片處理

電泳照片用Adobe Photoshop CS2 9.0進行裁剪；引物信息采用Excel 2003整理。

2結果與分析

用100對蒺藜苜蓿SSR引物進行親本母本溫嶺材料和父本楚雄材料及其雜交F1代多態性分析，篩選出8對多態性較好的作為南苜蓿特異性SSR引物，引物信息如表2所示。聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測PCR擴增產物，最后銀染上色，其結果見圖1、圖2。

試驗結果表明，蒺藜苜蓿SSR引物MtB152、MtB34、MtB147、MtB18、MtB21、MtB50、MtB16、MtB8在一年生苜蓿SSR-PCR反應體系中和苜蓿屬變種SSR-PCR反應體系中均能擴增出條帶，但條帶質量有差異。具體表現為一年生苜蓿SSR反應體系擴增出的產物經電泳檢測后得到的譜帶要比苜蓿屬變種的SSR反應體系擴增出的譜帶背景更加清晰，多態性位點更易于辨認，但擴增出的位點明顯少于苜蓿屬變種SSR的反應體系。在2種反應體系中，引物MtB18、MtB147、MtB50、MtB8擴增出的條帶數明顯多于其他引物，多態性好于其他引物。

基于一年生苜蓿SSR反應體系和苜蓿屬變種的SSR反應體系，分別采用聚丙烯酰胺凝膠電泳后對南苜蓿進行SSR標記檢測，均能夠得到穩定、易辨、背景清晰的譜帶，是一套快速有效的檢測方法。

3結論與討論

由于SSR的諸多優點以及技術的日趨成熟，已經成為一種比較理想的分子標記技術，被廣泛運用到多個領域。在農作物中，水稻（Oryza sativa）[14-15]、小麥（Triticum aestivum）[16-17]、玉米（Zea mays）[18]、大豆（Glycine max）[19]、大麥（Hordeum vulgare）[20]等都已進行了SSR標記的研究。

南苜蓿早期作為蔬菜和田間綠肥推廣[4]，在分子生物學研究方面，還沒有相關的文獻報導，導致其遺傳背景缺乏，試驗工作無法借鑒，給遺傳育種工作帶來了困難。試驗證明，根據南苜蓿的分類學地位，將其作為一年生苜蓿屬植物的屬性來研究，能夠開展SSR分子標記的研究。根據引物之間的通用性，已開發的蒺藜苜蓿SSR引物，通過聚丙烯酰胺凝膠電泳技術，在一年生苜蓿SSR-PCR反應體系和苜蓿屬變種的SSR-PCR反應體系的基礎之上，能夠擴增出條帶清晰、多態性高的譜帶，可以用于南苜蓿試驗分析與交流。

要想獲得清晰可靠的條帶可以改變引物的退火溫度、Mg2+濃度以及反應的循環數[21-22]。基于一年生苜蓿SSR反應體系的譜帶要比苜蓿屬變種的SSR反應體系的清晰，但是擴增出的位點數要少于苜蓿屬變種的反應體系，這可能與各自的反應體系的退火溫度及循環次數有關，需要進一步設計試驗來摸索證明，才能最終得到位點數多而且條帶清晰可靠的SSR-PCR反應體系。

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