產表面活性劑解烴菌的篩選及其發(fā)酵條件優(yōu)化

摘要：為了獲得產表面活性劑解烴菌，經血平板篩選和發(fā)酵液排油活性測定，從新疆石油污染土壤中分離出1株能產生物表面活性劑的石油降解菌B-1。通過形態(tài)和生理生化特征分析，初步鑒定該菌為芽孢桿菌屬（Bacillus sp.）。通過產量指標對菌株B-1 產生物表面活性劑的條件進行優(yōu)化，確定其最適發(fā)酵條件為：pH值7.5、溫度30 ℃、鹽濃度5 g/L，在此條件下，生物表面活性劑產量可達1.76 g/L。薄層色譜分析結果表明，B-1產脂肽、脂蛋白類生物表面活性劑，可將發(fā)酵液表面張力從68.20 mN/m降低到31.70 mN/m，乳化指數（E24）達到92.80%。

關鍵詞：石油降解菌；生物表面活性劑；表面張力；發(fā)酵條件

中圖分類號： S182文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2015）11-0437-03

收稿日期：2014-11-17

基金項目：新疆石河子大學優(yōu)秀青年項目（編號：2012ZRKXYQ10）。

作者簡介：楊樂（1980—），女，河南南陽人，碩士，講師，從事環(huán)境污染修復研究工作。E-mail：yl_shzu@163.com。生物表面活性劑是微生物在一定條件下分泌的胞外或者膜結合型的具有表面活性的兩性化合物，具有降低表面張力、穩(wěn)定乳化液等特性。由于微生物的差異性，其代謝產生的表面活性劑具有多樣的化學結構，包括脂肽、糖脂、磷脂、脂肪酸、中性脂質和聚合類生物表面活性劑[1-2]。與化學合成的表面活性劑相比，生物表面活性劑低毒，可生物降解，能適應極端環(huán)境，具有更好的選擇性和專一性、環(huán)境友好性等優(yōu)點，因而越來越受到人們的青睞，在社會生產和生活各領域具有廣泛的應用前景[3-4]。

碳氫化合物是導致環(huán)境退化的主要污染物，具有一定的毒性和疏水性，在土壤環(huán)境中難以自然降解，給生態(tài)安全和生物健康帶來了巨大風險。大量研究表明，生物表面活性劑通過乳化作用和降低油水界面張力，對疏水性石油烴具有增溶作用，提高了石油烴的可生物利用性，進而加快油污土壤的修復過程[5-8]。因此，篩選具有產表面活性劑和降解石油烴功能的微生物，在修復石油污染土壤方面具有重要的應用潛力。

本研究的目的是從新疆地區(qū)石油污染土壤中篩選具有高效產表面活性劑能力的石油烴降解菌，優(yōu)化該菌株產生物表面活性劑的發(fā)酵條件，同時考察其產生的生物表面活性劑類型和性能，以期為探索產表面活性劑的解烴菌在新疆石油污染土壤中的應用提供理論基礎。

1材料與方法

1.1試驗材料

試驗菌株分離土壤采自新疆獨山子石油污染土壤；原油取自獨山子煉油廠。

試驗所用培養(yǎng)基：（1）無機鹽培養(yǎng)基：1.0 g/L K2HPO4·3H2O，1.0 g/L KH2PO4，0.5 g/L MgSO4·7H2O，1.0 g/L NH4NO3，0.02 g/L CaCl2，痕量FeCl3，pH值7.5；（2）血平板，購自上海撫生生物科技有限公司；（3）發(fā)酵培養(yǎng)基：20 g/L葡萄糖，5 g/L蛋白胨，3 g/L酵母提取物，5 g/L NaCl，pH值75；（4）降解培養(yǎng)基：為無機鹽培養(yǎng)基，含1 g/L原油，pH值7.5。

1.2產生物表面活性劑解烴菌的篩選

稱取10 g土樣加入到含1 000 mg/L石油的100 mL無機鹽培養(yǎng)基中，于30 ℃、150 r/min進行富集培養(yǎng)，每隔5 d取培養(yǎng)液并以10%的轉接量依次轉入新鮮無機鹽培養(yǎng)基中，并逐步提高石油濃度到1 500、2 000、2 500、3 000 mg/L。通過觀察石油消失與否判斷石油的降解程度，連續(xù)馴化傳代5次后，取0.1 mL培養(yǎng)液涂布于血平板上培養(yǎng)24 h，選擇周圍有溶血圈的菌落，挑取單菌落，連續(xù)劃線純培養(yǎng)3次，得到1株純化菌株，命名為B-1，挑取菌株到LB斜面進行保存?zhèn)溆谩⑿泵姹４娴木闎-1接入發(fā)酵培養(yǎng)基中，恒溫（30 ℃、150 r/min）培養(yǎng)48 h，測定發(fā)酵液排油圈大小，以確定其是否能夠產生生物表面活性劑。

1.3菌株鑒定

將所篩選菌株接種于牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基中，在30 ℃下培養(yǎng)24 h，觀察菌落外部形態(tài)特征，參照《常見細菌鑒定手冊》[9]對菌株B-1進行生理生化特性鑒定。

1.4種子培養(yǎng)和發(fā)酵培養(yǎng)

種子培養(yǎng)：從LB斜面中挑取1環(huán)菌接種于裝有100 mL發(fā)酵液的錐形瓶中，于30 ℃、150 r/min培養(yǎng)24 h。

發(fā)酵培養(yǎng)：取培養(yǎng)24 h的種子液，以1%的接種量接種至裝有100 mL發(fā)酵液的錐形瓶中，于30 ℃、150 r/min培養(yǎng) 48 h。

1.5生物表面活性劑的提取

將菌株B-1培養(yǎng)48 h的發(fā)酵液離心（4 ℃、6 000 r/min，10 min）去除菌體，上清液用6 mol/L HCl調節(jié)pH值為2.0，4 ℃靜置過夜收集沉淀物（4 ℃、8 000 r/min，15 min），再用二氯甲烷萃取沉淀物并離心收集（4 ℃、10 000 r/min，10 min），抽真空干燥至恒質量，確定表面活性劑產量。

1.6發(fā)酵條件的優(yōu)化

1.6.1pH值對生物表面活性劑產量的影響 將菌株B-1的種子液按體積分數1%接入到發(fā)酵培養(yǎng)基中，利用HCl、NaOH溶液分別將pH值調節(jié)為6.0、7.0、7.5、8.0、9.0，在 30 ℃、150 r/min培養(yǎng)48 h，按照上述提取生物表面活性劑的方法，研究初始pH值對生物表面活性劑產量的影響。

1.6.2溫度對生物表面活性劑產量的影響確定發(fā)酵培養(yǎng)基的最適pH值后，將菌株B-1接種于新鮮發(fā)酵培養(yǎng)基中，分別放置于20、25、30、35、40 ℃條件下，在初始pH值為7.5的條件下培養(yǎng)48 h，按照生物表面活性劑的提取方法對生物表面活性劑進行提取和測定，研究發(fā)酵培養(yǎng)基的最適溫度。

1.6.3鹽濃度對生物表面活性劑產量的影響用NaCl調節(jié)發(fā)酵培養(yǎng)基中的鹽濃度分別為0、5、10、30、50、70 g/L，在pH值為7.5、溫度30 ℃條件下培養(yǎng)48 h，提取發(fā)酵液中的生物表面活性劑，研究發(fā)酵培養(yǎng)基的最適鹽濃度。

1.7生物表面活性劑性能的測定

生物表面活性劑的定性分析：取0.1 g生物表面活性劑溶解于50 mL甲醇中，在硅膠板上采用薄層色譜法進行分析[10]。

生物表面活性劑穩(wěn)定性評價：以未接菌的培養(yǎng)液作對照，將菌株B-1活化后接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，在30 ℃、150 r/min條件下培養(yǎng)48 h，參照文獻[11-12]的方法，取一定量的發(fā)酵上清液進行排油試驗，以及表面張力、乳化指數（E24）的測定，相應公式如下：

E24=乳化層高度/混合液總高度×100%。2結果與分析

2.1產生物表面活性劑解烴菌的篩選與鑒定

2.1.1菌株的篩選經富集分離和純化，從獨山子石油污染土壤中篩選出能夠降解石油并在血平板培養(yǎng)過程中出現溶血圈的菌株1株，命名為B-1。通過發(fā)酵培養(yǎng)和排油活性測定，石油降解菌B-1能夠形成6.0 cm的排油圈，而對照液滴則由石蠟穿過，沒有排油圈形成。一般而言，排油圈的直徑與表面活性劑含量成正比，試驗結果表明，菌株B-1能夠產生表面活性物質。

2.1.2菌株的鑒定菌株B-1菌落呈乳白色，不透明，較干燥，有褶皺，在血瓊脂培養(yǎng)基上形成溶血圈；菌體為革蘭氏陽性桿菌，有芽孢，無莢膜，有鞭毛，能運動。B-1主要生理生化特征見表1，分析可知，菌株B-1為芽孢桿菌屬細菌（Bacillus sp.）。

表1菌株B-1主要的生理生化特性

指標類型特性氧化酶-H2O2酶+淀粉水解+M.R試驗-V.P.試驗+吲哚試驗-葡萄糖利用產酸不產氣硝酸鹽還原+明膠液化+注：“+”“-”分別表示試驗結果為陽性、陰性。

2.2發(fā)酵條件優(yōu)化

生物表面活性劑是微生物的次生代謝產物，不同微生物合成代謝物的最適環(huán)境條件差異較大。環(huán)境條件會影響微生物的生長及次生代謝產物的產生，因此需要從pH值、溫度、鹽濃度方面對B-1的發(fā)酵條件進行考察優(yōu)化。

2.2.1初始pH值對菌株B-1產表面活性劑的影響從圖1可見，初始pH值對菌株B-1產表面活性劑的影響較小，在pH值6.0～9.0的范圍內都可以產生表面活性物質；隨著培養(yǎng)基初始pH值的增加，菌株分泌表面活性劑的量增加，當培養(yǎng)基初始pH值為7.5時表面活性劑產量達到最大值，為176 g/L；隨后隨著pH值增加，產量下降，與已報道的表面活性劑產生菌的最適pH值6.0～7.0相比，芽孢桿菌B-1更適應于偏堿性的環(huán)境。

2.2.2溫度對菌株B-1產表面活性劑的影響從圖2可以看出，隨著培養(yǎng)溫度的升高，表面活性劑產量增加，在30 ℃時，菌株B-1的表面活性劑產量達到最大值；隨后表面活性劑產量開始下降，在40 ℃時，B-1表面活性劑產量最低。

2.2.3鹽濃度對菌株B-1產表面活性劑的影響由圖3可見，鹽濃度在0～10 g/L對降解菌B-1產表面活性劑的影響較小，當培養(yǎng)基含鹽量為5 g/L時，表面活性劑產量達到最大值；鹽濃度超過30 g/L時，開始抑制表面活性劑的產生；菌株B-1有較高的耐鹽能力，在鹽濃度為 70 g/L時仍然分泌表面活性物質。研究結果表明，菌株B-1受低滲透壓的影響不大，有一定耐受高滲透壓的能力，具備在一定鹽堿環(huán)境中降解石油污染物的基礎。綜合以上研究，石油降解菌B-1產表面活性劑的最適條件為pH 值7.5、溫度 30 ℃、鹽濃度5 g/L，在此條件下，生物表面活性劑產量可達1.76 g/L。

2.3生物表面活性劑的定性分析

生物表面活性劑包括糖脂、脂肽、磷脂質、中性脂、脂肪酸和高分子脂類物質，生物表面活性劑的類型既與菌株有關，又與底物有關。先將菌株B-1培養(yǎng)48 h，再將發(fā)酵液離心，取上清液酸化（pH值為2），放置于冰箱中過夜，有白色沉淀產生；經薄層色譜法定性分析，與莫氏試劑接觸后不顯色，表明樣品中沒有糖類成分，而與茚三酮接觸后顯色，表明樣品中有氨基存在，初步判定生物表面活性劑為脂肽、脂蛋白類物質。

2.4生物表面活性劑性能評價

表面活性劑性能評價方法包括測定排油活性、表面張力、油水乳化穩(wěn)定性、臨界膠束濃度及HLB值（親水親油平衡值）等，以未接菌的發(fā)酵液為對照，在最優(yōu)發(fā)酵條件下，分別測定菌株B-1發(fā)酵上清液的排油活性、表面張力和油水乳化穩(wěn)定性。

研究結果表明，菌株B-1在石蠟液面能夠形成直徑為7.5 cm的排油圈，而對照沒有排油圈形成；此外，解烴菌B-1能顯著降低發(fā)酵液的表面張力，由最初的68.20 mN/m降到31.70 mN/m，表明該菌株具有較高的表面活性。將B-1發(fā)酵液與液體石蠟混合，靜置24 h后測定的乳化指數為9280%，大于50%，表明該菌株具有較強的乳化活性和穩(wěn)定性。

3結論

從新疆石油污染土壤中篩選出1株產生物表面活性劑石油降解菌，命名為B-1，形態(tài)和生理生化初步鑒定表明，B-1為芽孢桿菌屬細菌（Bacillus sp.）。菌株B-1所產的生物表面活性劑初步判定為脂肽、脂蛋白類物質，采用單因素試驗對菌株的發(fā)酵條件進行優(yōu)化，得到其最適pH值為7.5，培養(yǎng)溫度為30 ℃，鹽濃度為5 g/L，在此條件下，生物表面活性劑產量可達1.76 g/L。在最優(yōu)發(fā)酵條件下，菌株B-1能將發(fā)酵液的表面張力由68.20 mN/m降至31.70 mN/m，表明該菌株具有較強的降低表面張力的能力；油水乳化指數為92.80%，表明該菌株具有較強的乳化活性和穩(wěn)定性，在石油污染土壤生物修復過程中具有較高的實用價值和應用前景。

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