玉米抗旱性功能基因研究進展

高志勇，謝恒星，王志平，劉史力

(1 渭南師范學院化學與環境學院，陜西渭南 714099； 2 陜西省河流濕地生態與環境重點實驗室，渭南 714099)

玉米抗旱性功能基因研究進展

高志勇1，2，謝恒星1，2，王志平1，2，劉史力1

(1 渭南師范學院化學與環境學院，陜西渭南 714099； 2 陜西省河流濕地生態與環境重點實驗室，渭南 714099)

介紹了干旱及其對玉米的影響，概述了玉米抗旱性功能基因克隆方法和技術的研究進展，包括全基因組關聯分析、候選基因關聯分析、轉錄組研究及蛋白質組研究等研究方法及進展。展望了玉米基因功能研究的發展前景。

玉米；抗旱性；功能基因

玉米有著古老的種植和培育歷史，是三大糧食作物(水稻、小麥、玉米)之一。培育玉米優良品種，增強其抗旱性，與其產量緊密相關，目前有著重要的現實意義。玉米抗旱性包括干旱屏蔽和耐旱性兩個方面。高等植物主要通過干旱屏蔽方式抵抗水分脅迫，其表現如玉米、水稻等植物，在干旱條件下出現葉片卷曲，以減少水分丟失。有些植物則是通過氣孔內陷，產生蠟質保護性物質，葉片減小或退化，以減少蒸騰作用；有的則是使根系分布廣而深，輸導組織發達，增強對水分的吸收及運輸，有利于保持植物的水分平衡，避免發生水分虧缺。在許多較低等的植物，如苔蘚、地衣等中，可通過耐旱性方式抵抗干旱，其機理是它們的原生質具有能忍耐脫水而不受永久性傷害的能力。大多數高等植物(除種子及花粉外)耐旱性很弱。目前，深層次挖掘玉米本身存在的抗旱分子機制研究仍舊十分缺乏，玉米抗旱性以及一些重要農藝性狀基因克隆進展緩慢，這方面的研究亟需開展，以促進玉米的遺傳育種工作，獲得優質高產的抗旱性玉米品種。

1 干旱對玉米生長的影響

干旱是指由于長時期的降水偏少，造成空氣干燥，土壤缺水，植物體內的水分相應發生虧欠，影響了植物體的正常生長發育，從而引起減產的一種農業氣象災害。在當今世界，干旱問題非常嚴重，地球土地的總面積中，約有35%屬于干旱及半干旱地區；而在世界總耕地面積中，干旱及半干旱地區更是占了43.9%[1]。在旱地作物中，玉米對水分脅迫非常敏感，生長中需水量較大，在整個生長周期內，一般需要至少2500 mm的降水量，而且生長期內的需水量變化很大，除苗期可適當干旱(蹲苗)外，從拔節到成熟都應保證良好的水分供應[2]。因此，在引起干旱及半干旱地區玉米減產的諸多因素中，干旱是最主要的非生物逆境脅迫因子[3]。我國每年種植的玉米中，受到干旱影響的面積占了大約60%，造成減產20%～30%。玉米不同的發育期受干旱的影響不同。就產量而言，開花期受干旱的影響最大，而苗期和灌漿期受影響的程度相對小一些。品種間基因型有所不同，受到的影響也有較大的不同。因此，進行玉米的抗旱相關基因和抗旱的遺傳和生理基礎研究，進而挖掘抗旱性相關基因資源，從而選育出高抗旱性品系，是解決干旱對玉米生產影響的長遠之計[4]。

2 玉米功能基因克隆方法

基因是遺傳物質的最基本單位，也是所有生命活動的物質基礎。不論是要揭示某個基因的功能，還是要改變某個基因的功能，都必須首先將其克隆出來。特定功能基因的克隆，是整個基因工程或分子生物學的起點。目前玉米功能基因的克隆中，主要采用以下幾種方法。

2.1 全基因組關聯分析

全基因組關聯分析在玉米基因研究上有重要作用。玉米是花單性的雌雄同株作物，其遺傳多樣性非常高，在其基因組中，有著非常豐富的遺傳變異，目前公用數據庫中，僅SNP標記，就已經超過了一百萬。為了尋找優良抗旱相關基因，采用關聯分析方法，能對玉米抗旱能力的遺傳基礎進行剖析。近些年來，應用關聯分析方法，已在研究玉米抗旱性方面取得了較大的進展。利用熱帶和亞熱帶共350個自交系組成的關聯群體，研究了全基因組范圍內不同代謝途徑、生殖生長發育和抗逆響應有關的候選基因，已開發了共1536個SNP標記，并將來源于540個候選基因的1229個SNP標記進行了關聯分析，包含已報道和脫落酸以及碳水化合物代謝途徑有關的基因115個；在水分脅迫環境中，花期檢測到3條染色體上有4個候選基因的SNP，與脫落酸或蔗糖含量顯著關聯[5]。

目前，測序技術和高通量芯片等其它基因組分析技術正在快速發展，大量獲取全基因組SNP標記或重測序數據已不再是技術限制因素?；谌蚪M重測序或高密度芯片檢測，進行玉米等復雜性狀全基因組關聯研究(genome-wide association study，GWAS)的基因發掘，已取得很大進展。人工創造的高油玉米是研究基因組進化的特異材料。該研究利用包含高油玉米的368份玉米自交系為材料，利用RNA-seq方法進行了籽粒發育期的轉錄組大規模測序，挖掘出了103萬SNP，獲得了28 769個基因的表達量數據，同時分析了兩年4點的籽粒油分相關性狀?；谌蚪M關聯分析，共發現74個座位與籽粒油分相關性狀顯著關聯，其中1/3的座位編碼油脂代謝的關鍵酶；鑒定出了26個與籽?？偤土匡@著相關的座位，能解釋83%的表型變異。這項研究還發現，人工長期選擇的高油玉米僅在有限基因組位點發生改變，有利等位基因的累加可能是高油玉米油分增加的主要原因。該研究還發掘出一些玉米油分相關性狀的有利等位基因，從全基因組水平較深入地解析了玉米籽粒油分的遺傳基礎，為認識高油玉米的遺傳結構變異提供了理論基礎，對進一步改良玉米油分的含量和質量有重要指導意義。

當前利用全基因組測序基因分型(Genotyping-by-Sequencing，GBS)方法，在玉米基因功能研究方面，也取得了迅速進展，獲得了大量的玉米基因組學信息，采集了約20億個全基因組信息數據，完成了4000份材料基于測序的基因型分析工作，這其中約500個系還具備較完備的耐旱性評價資料。

2.2 候選基因關聯分析

研究中，只對可能影響目標性狀的基因進行功能鑒定，以驗證其等位變異，是否控制了目標性狀并發掘出優良的等位基因，這是候選基因關聯分析的主要研究內容。候選基因關聯分析，需要充分利用連鎖分析、突變分析、生化途徑和比較基因組學等方法所提供的信息，來尋找候選基因，通過在關聯群體中對候選基因進行重測序，來檢測多態性位點與目標性狀的關聯。該方法在玉米維生素A、番茄紅素環化酶和β胡蘿卜素羥化酶等方面，已取得了顯著研究進展。在玉米實驗中，用106份玉米自交系，擴增出了平ivr2基因全長DNA序列，并進行了序列多態性分析。利用候選基因關聯分析的方法，在正常水分和干旱脅迫條件下，對產量及構成因素進行分析，共檢測到48對標記和性狀顯著關聯，并推測基因488位點與玉米耐旱性相關[6]。9-順環氧類胡蘿卜素雙加氧酶和RAB28在脫落酸生物合成和干旱應答上起著積極作用。實驗用196份自交系為材料擴增nced和rab28基因全長DNA序列，在海南三亞和新疆烏魯木齊進行大田抗旱性鑒定共考察20個形態、產量及產量組成性狀，利用候選基因關聯分析的方法，nced和rab28基因在水分脅迫下分別檢測到13個和11個多態性位點和目標性狀顯著關聯，該結果有助于進一步開發抗旱功能標記和分子育種[7]。以3個重組自交系和305個自交系組成的關聯群體，用2052個SNP進行基因型鑒定，以ASI為抗旱性鑒定指標，發現結合連鎖和連鎖不平衡的聯合作圖能提高QTL定位的檢測效率，整合定位比單獨定位多定位到18個QTL，而用單倍型分析可以進一步提高定位效率，并定位到編碼SET結構域蛋白和酸酮還原酶2個候選基因[8]。

2.3 轉錄組分析研究

利用基因表達譜分析，可以對干旱脅迫下相關基因的表達水平進行研究，探索與脅迫響應相關的基因調控網絡，可能有助于確定與抗旱相關的候選基因。研究用2個抗旱和1個敏感的墨西哥玉米地方品種，對干旱脅迫和恢復灌溉前后基因表達水平進行研究，發現抗旱品種的基因表達水平變化幅度比敏感品種大，尤其在恢復灌溉后差異最為明顯，顯示抗旱品種在水分脅迫后能更有效地激活抗旱相關基因的表達[9]。實驗中利用cDNA微陣列技術，對水分脅迫下玉米籽粒發育過程中胎座和胚乳的基因表達水平進行分析，與對照組相比，胎座中有79個基因的表達水平發生了明顯的變化，其中89%的基因表達表現為上調變化，這其中多為熱激蛋白、分子伴侶和結構蛋白；胚乳中有56個基因的表達水平發生明顯的變化，其中82%的基因表現為下調表達，其中多數和細胞分裂及生長有關[10]。利用IBM Syn10雙單倍體群體和寡核苷酸芯片技術，對玉米根部所有基因的表達水平進行表達QTL分析，鑒定了大量的cis和trans QTL，同時探討了假陽性和假陰性的問題，并精細定位和圖位克隆了一個與脫落酸8'-羥化酶表達有關的順式QTL，推測谷酰胺轉氨酶是一個主要的候選基因[11]。從B73和H99組配的120個重組自交系群體中，挑選出了抗旱能力差異最大的2個抗旱系和2個敏感系，利用芯片技術，對正常水分和水分脅迫下授粉10 d后玉米籽粒中基因的表達水平進行研究，發現有252個基因顯著受到干旱脅迫影響，通過遺傳和電子定位有88個差異表達的基因定位到連鎖圖上，并與抗旱相關性狀QTL定位的結果進行比較，有22個差異表達的基因定位在抗旱性相關QTL區域，推測是重要的抗旱候選基因[12]。

Fernandes等[13]利用基因芯片的方法，在多種逆境脅迫環境中，研究B73的基因表達譜變化，從得到的實驗結果看出，同正常條件相比，模擬干旱處理(11%的甘露醇處理)條件下，共有349個基因發生了下調表達，128個基因發生了上調表達。其中有40個基因在干旱、鹽和低溫條件下都下調表達，而有17個基因在這3種逆境下都表現上調表達。這些在3種逆境條件下都上調或下調表達的基因，可能處于玉米對不同逆境脅迫響應基因表達調控網絡的關鍵位點，對于玉米在抗逆性方面的改良具有重要作用。Zheng等[14]利用基因芯片的方法，對優良耐旱自交系Han21和對干旱敏感的自交系Ye478進行研究，從實驗結果看出，在水分脅迫環境中，參與ABA信號途徑的信號傳輸相關蛋白PP2C (蛋白磷酸酶2C，ABA信號途徑的負調控因子)、SnRK2、Vp14(與AtNCED3同源，是ABA合成的關鍵酶)等基因，參與活性氧清除的酶和轉錄因子(DREB2、NAC)等基因受到顯著的誘導調控表達。其中水分脅迫環境中，兩個材料中差異表達的基因共有827個，其中與離子轉運、蔗糖轉運、細胞壁纖維素合成相關酶類、果膠脂酶等基因對于兩個自交系的耐旱性差異可能具有重要的作用。但是僅根據基因表達譜的研究結果，尚不能確定差異表達的基因對于特定玉米自交系耐旱性的提高是否具有正向效應；通過基因芯片的方法研究基因表達譜的變化，不能檢測出在玉米干旱脅迫過程中表達豐度較低但可能具有重要作用的調控類蛋白基因；通過基因芯片的方法不能檢測出不同自交系間在耐旱相關同源基因在拷貝數上的差異。目前，RNA測序技術(RNA-Seq)的應用已經徹底改變了轉錄組學方面的認識。RNA測序又稱為轉錄組測序，是新近發展起來的利用深度測序技術進行轉錄組分析的技術。該技術能夠在單核苷酸水平上對物種的整體轉錄活性進行檢測，在分析轉錄本的結構和表達水平的同時，還能發現一些位置的轉錄本和稀有轉錄本，精確識別可變剪切位點以及編碼區的單核苷酸多態性，可以提供更為全面的轉錄組信息。相對于基因芯片技術，RNA-Seq技術無需預先針對已知序列設計探針，即可對任意物種的整體轉錄譜變化進行檢測，能提供更加精確的數字化信號、更高的檢測通量和更廣泛的檢測范圍。

2.4 蛋白質組分析研究

在生物體中，蛋白質直接執行各項生理功能，控制著所有生命活動，因此，只從DNA和mRNA水平對植物的抗旱功能進行研究，得出的結論尚不夠全面。目前，高通量的蛋白質組學研究方法不斷發展，像2D雙向電泳和質譜分析，使得可以對蛋白質的表達水平進行定量分析。但是在蛋白質組水平上研究玉米抗旱相關基因的報道還比較少。實驗中，對正常水分和干旱脅迫下，不同時間段(4～14 d)玉米葉片基部蛋白質表達水平進行定量分析，結果顯示有46種蛋白質表達水平顯著增加，但是不同蛋白質的表達模式有著差異，且在不同自交系中也不一樣，因此推測一些蛋白質表達水平的差異，可能與玉米抗旱性相關[15]。

了解作物干旱的響應機制，是抗旱性基因型育種的第一步。在中度干旱條件下，分析兩個對脫水反應敏感性相反基因型的玉米。在敏感的玉米品種中，生理參數的分析揭示了氣孔導度降低，伴隨著相對含水量輕微的降低。與此相反，甚至在脫水條件下，抗性基因型保持氣孔張開和明顯的光合作用。雙向凝膠電泳和iTRAQ兩個獨立方法分析了干旱引起的葉片蛋白質組變化，從而提供了一致但部分重疊的結果。干旱導致這兩種基因型保護和與脅迫有關的蛋白質上升(主要是伴侶和脫水蛋白)。兩種基因型在各種解毒蛋白水平的差異與觀察到抗氧化酶活性的變化相對應。在敏感基因型，保護蛋白質的上調種類和水平通常較低，這意味著合成蛋白處于較低水平，同時也表明蛋白翻譯系統的成分特異變化。基于這些結果，認為敏感基因型超敏感的氣孔早期關閉，導致光合作用的抑制，并隨后與耐旱有關的保護/解毒蛋白合成效率降低。

3 展望

總體看來，在玉米的抗旱性研究上，形態指標和生理指標是比較傳統的方法，雖然在玉米抗旱QTL定位上也取得了一些進展，克隆了一些抗旱基因，但還遠沒有揭示出復雜的玉米抗旱機制，這方面的工作亟需加強。當前，玉米突變體的創制和篩選，玉米突變體庫的構建，玉米抗旱基因的克隆，基因功能的揭示，玉米抗旱性的基因表達調控網絡的進一步解析等乃是當務之急，這也是一個長久且艱巨的任務，并將對作物抗旱研究及育種實踐起到極大的推動作用。

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Advances in Research on Functional Genes of Drought Resistance in Maize

GAO Zhiyong1，2，XIE Hengxing1，2，WANG Zhiping1，2，LIU Shili1

(1 School of Chemistry and Environment，Weinan Normal University，Weinan，Shaanxi 714099，China； 2 Key Laboratory for Ecology and Environment of River Wetlands in Shaanxi Province，Weinan，Shaanxi 714099，China)

Drought and its impact on maize were introduced.Overview was made about the cloning methods and technology research progress of the maize drought resistant functional gene，including genome-wide association analysis，candidate gene association analysis，transcriptome research，proteome research methods and progress.The development prospects of the research on the function of maize gene were prospected in the end of the paper.

maize； drought resistance； functional genes

2016-08-09

高志勇(1966-)，男，博士，副教授，研究方向：植物分子生物學，Email：shandonggaozhiyong@126.com。

陜西省教育廳2016年重點科學研究計劃項目(16JS031)；渭南師范學院理工類人才基金項目(2015ZRRC02)；渭南師范學院科研計劃項目(15YKF003)。

S513.01

A

1001-5280(2016)06-0732-04

10.16848/j.cnki.issn.1001-5280.2016.06.31