談法醫(yī)分子病理學(xué)研究實(shí)踐

田云霞，徐海宇內(nèi)蒙古呼倫貝爾市阿榮旗公安局刑事科學(xué)技術(shù)室

談法醫(yī)分子病理學(xué)研究實(shí)踐

田云霞，徐海宇
內(nèi)蒙古呼倫貝爾市阿榮旗公安局刑事科學(xué)技術(shù)室

在法醫(yī)病理學(xué)研究領(lǐng)域里，出現(xiàn)了很多運(yùn)用分子病理學(xué)的基礎(chǔ)性研究和相關(guān)的應(yīng)用研究。此外，除了同一認(rèn)定之外，分子病理學(xué)還有其他用途，如：確定死亡方式和死亡原因、確定死亡時(shí)間和血痕形成時(shí)間、組織確認(rèn)、損傷時(shí)間推斷、毒理遺傳學(xué)等。有學(xué)者使用分子病理學(xué)技術(shù)診斷心律失常，并提出了分子解剖的概念。與臨床研究不同，法醫(yī)病理的主要對(duì)象還是尸體組織，尤其是腐敗組織，或者甲醛浸泡的組織。也正因如此，法醫(yī)學(xué)者不太可能依靠分子病理來(lái)解決所有的問(wèn)題，我們的目的是嘗試解決一些基本的、常見的問(wèn)題。

法醫(yī)；分子病理學(xué)；研究實(shí)踐

在法醫(yī)病理學(xué)研究領(lǐng)域里，出現(xiàn)了很多運(yùn)用分子病理學(xué)的基礎(chǔ)性研究和相關(guān)的應(yīng)用研究。此外，除了同一認(rèn)定之外，分子病理學(xué)還有其他用途，如：確定死亡方式和死亡原因、確定死亡時(shí)間和血痕形成時(shí)間、組織確認(rèn)、損傷時(shí)間推斷、毒理遺傳學(xué)等。有學(xué)者使用分子病理學(xué)技術(shù)診斷心律失常，并提出了分子解剖的概念。與臨床研究不同，法醫(yī)病理的主要對(duì)象還是尸體組織，尤其是腐敗組織，或者甲醛浸泡的組織。也正因如此，法醫(yī)學(xué)者不太可能依靠分子病理來(lái)解決所有的問(wèn)題，我們的目的是嘗試解決一些基本的、常見的問(wèn)題。

一、死亡原因

確定死亡原因有不同的方法，而不同的方法對(duì)應(yīng)不同的檢驗(yàn)對(duì)象。傳統(tǒng)死因確定的方法是尸體解剖，解剖用于推斷死亡原因時(shí)，有個(gè)別案件由于缺乏形態(tài)學(xué)的陽(yáng)性改變，故分析死因時(shí)存在一定的困難。解剖加上其他一些輔助性方法，如組織化學(xué)、死后生化和毒物分析等方法后，大多數(shù)案件可以正確診斷死因。但是還是會(huì)有很少部分的案件難以診斷出來(lái)，如心律失常死亡案件。此外，青少年猝死案例中很多就死因不明，據(jù)統(tǒng)計(jì)約有30%青壯年心源性猝死案例解剖時(shí)是陰性的。這部分案例中，很多都有家族遺傳傾向。這種情況下，檢測(cè)突變基因就變得極為重要。但是檢測(cè)突變基因時(shí)要注意這些突變?cè)诠δ苌系闹匾裕约斑@些基因突變與死因存在的直接關(guān)聯(lián)性。

感染性疾病的診斷。分子病理學(xué)技術(shù)在診斷感染性疾病方面也有重要作用，而且可用于年代久遠(yuǎn)的尸體組織疾病診斷，如木乃伊組織。在法醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，該技術(shù)目前主要用于診斷心肌炎。

常見的引起病毒性心肌炎的病毒包括腺病毒、腸道病毒、禽流感病毒、細(xì)小病毒B19等。活體上病毒性心肌炎的診斷除了依靠病史和臨床檢查外，還需要心內(nèi)膜活檢。活檢的心內(nèi)膜可通過(guò)PCR、RT－PCR以及原位雜交、免疫組化來(lái)尋找病毒感染的證據(jù)。但是分子病理檢測(cè)結(jié)果與免疫組織化學(xué)染色診斷結(jié)果不一定相關(guān)。如形態(tài)學(xué)上正常的心臟可出現(xiàn)病毒檢測(cè)陽(yáng)性，反之亦然。心肌內(nèi)檢出病毒可以用于死因診斷，尤其是出現(xiàn)了心肌壞死、心肌細(xì)胞自溶以及淋巴單核細(xì)胞浸潤(rùn)時(shí)更是如此。已經(jīng)有一些有關(guān)猝死案例中檢出病毒的文獻(xiàn)報(bào)道。對(duì)于嬰幼兒猝死綜合征來(lái)說(shuō)，大概30%的案例可檢出病毒，尤其是腸病毒、腺病毒或者細(xì)小病毒B19等，而這些發(fā)現(xiàn)可作為死因診斷的依據(jù)。

二、RNA分析

死后RNA分析在法醫(yī)中很有應(yīng)用價(jià)值，如可用于組織鑒定或者死亡時(shí)基因表達(dá)水平的判定。死亡時(shí)基因表達(dá)水平的判定對(duì)于死因和死亡環(huán)境、存活時(shí)間、疾病的病理生理變化以及損傷判定來(lái)說(shuō)很有意義。但是基因表達(dá)水平的判定，首先要解決的問(wèn)題是死后內(nèi)參基因的選擇問(wèn)題。RNA分析能為判斷引起死亡的疾病及死亡機(jī)制提供思路，也有望成為法醫(yī)病理死因診斷的有力工具。當(dāng)然還有一些其他應(yīng)用，如判定損傷時(shí)間、死亡時(shí)間及體液鑒定等。

1.血痕形成時(shí)間和死亡時(shí)間判定

體外RNA降解是一個(gè)復(fù)雜而非線性的過(guò)程，但是其降解程度可用做斑痕質(zhì)量和形成時(shí)間判定的指標(biāo)。Bauer等（2008）研發(fā)了一種聯(lián)合使用半定量雙RT－PCR和競(jìng)爭(zhēng)式RT－PCR的方法來(lái)量化RNA降解水平。他們采用這種方法研究了106例血痕。這些血痕保存時(shí)間最長(zhǎng)達(dá)15年。結(jié)果發(fā)現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)品與目的基因mRNA的峰面積比值與樣品保存時(shí)間相關(guān)。血痕形成時(shí)間差別在5年及以上的樣品中，標(biāo)準(zhǔn)品與目的基因mRNA峰面積比值具有明顯差異。此外Bauer等（2003）也利用FASN多重PCR方法對(duì)PNA片段進(jìn)行定量，并表明這些RNA量與死亡時(shí)間相關(guān)。總RNA降解在實(shí)驗(yàn)條件下是一個(gè)緩慢的過(guò)程，因此可用于死亡時(shí)間3～4d之內(nèi)的PMⅠ研究。

2.體液鑒定

通過(guò)測(cè)定組織細(xì)胞特異性基因mRNA量來(lái)鑒定組織是一種除DNA分型以外的另一種新技術(shù)。這里面最主要的是選取組織特異性的基因，通過(guò)反轉(zhuǎn)錄PCR來(lái)研究該特異性基因的表達(dá)情況。如基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP）mRNA只存在于子宮內(nèi)膜細(xì)胞而不能在其他血細(xì)胞和上皮細(xì)胞內(nèi)檢出，因此可作為內(nèi)膜細(xì)胞特異性基因，即有望成為月經(jīng)血的特異性指標(biāo)。進(jìn)一步的月經(jīng)血斑痕研究顯示MMP表達(dá)水平確實(shí)可作為月經(jīng)血檢測(cè)的特異指標(biāo)。

3.mRNA

目前通過(guò)mRNA定量分析來(lái)鑒定體液是一種標(biāo)準(zhǔn)的常用方法。也有很多研究逐步改善了該方法，以提高方法的精確度，擴(kuò)大該方法檢測(cè)的生物檢材種類。然而，mRNA在死后容易降解，因此其穩(wěn)定性一直是檢測(cè)基因表達(dá)時(shí)的關(guān)注點(diǎn)。有研究報(bào)道m(xù)RNA降解后，受損的"八完整性會(huì)影響到檢測(cè)效果。這對(duì)法醫(yī)采用mRNA定量來(lái)說(shuō)尤其重要，因?yàn)榉ㄡt(yī)碰到的檢材經(jīng)常暴露于蚊蟲、紫外線、溫度、濕度等潛在促進(jìn)mRNA降解的環(huán)境中。雖然mRNA穩(wěn)定性廣受質(zhì)疑，但是毫無(wú)疑問(wèn)的一點(diǎn)是，某一小段長(zhǎng)度的單鏈RNA可能不易降解而具有較好的穩(wěn)定性。因此在法醫(yī)領(lǐng)域具有重要的研究?jī)r(jià)值。

4.法醫(yī)病理學(xué)家對(duì)死者親屬的責(zé)任

檢測(cè)到死者突變基因后，法醫(yī)也有責(zé)任對(duì)死者家屬進(jìn)行風(fēng)險(xiǎn)告知和遺傳咨詢。當(dāng)分子解剖得出合理的死因之后，法醫(yī)也有義務(wù)告知家屬所有的解剖結(jié)果。由于一些遺傳疾病，如擴(kuò)張性心肌病和長(zhǎng)QT綜合征等具有遺傳傾向，死者家屬也很有可能罹患同樣的疾病，因此告知家屬可以有效預(yù)防悲劇再生。遺傳咨詢是對(duì)心源性猝死者家屬關(guān)懷必不可少的一部分，因此，需要法醫(yī)病理學(xué)家、醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)家以及心臟病學(xué)家通力合作。法醫(yī)病理學(xué)家的基本任務(wù)就是要考慮到心源性猝死案例的遺傳因素，并且合理保存組織檢材以備后續(xù)基因分析。