靶向沉默Mcl-1基因對感染不同毒力結核桿菌小鼠腹腔巨噬細胞凋亡的影響*

王飛雨，　王新敏，　王　嬋，　王小芳，　張宇晴，　吳江東，　吳　芳，　張萬江，　章　樂△

(石河子大學醫學院 1病理生理學教研室， 2病原生物學與免疫學教研室， 3第一附屬醫院泌尿外科，4新疆地方與民族高發病教育部重點實驗室，新疆 石河子 832002)

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靶向沉默Mcl-1基因對感染不同毒力結核桿菌小鼠腹腔巨噬細胞凋亡的影響*

王飛雨1,4，王新敏3，王嬋2,4，王小芳1,4，張宇晴1,4，吳江東1,4，吳芳1,4，張萬江1,4，章樂1,4△

(石河子大學醫學院1病理生理學教研室，2病原生物學與免疫學教研室，3第一附屬醫院泌尿外科，4新疆地方與民族高發病教育部重點實驗室，新疆 石河子 832002)

[摘要]目的： 通過RNA干擾技術特異性沉默Mcl-1基因，探討下調Mcl-1基因對感染不同毒力結核桿菌小鼠腹腔巨噬細胞凋亡的影響。方法: 分別用制備好的新疆地區流行的優勢強毒結核分枝桿菌臨床分離株(簡稱強毒株)、結核分枝桿菌國際標準強毒株p7Rv(簡稱p7Rv)、結核分枝桿菌國際標準無毒株p7Ra(簡稱p7Ra)和卡介苗(BCG)菌懸液感染BALB/c小鼠，再以篩選并構建好的Mcl-1-shRNA作用于感染的小鼠模型，同時設立相應對照組，于作用后1 d、3 d、5 d和7 d提取小鼠腹腔巨噬細胞，應用實時熒光定量PCR和Western blot檢測各組小鼠腹腔巨噬細胞中Mcl-1 mRNA和蛋白的表達；應用流式細胞術檢測各組巨噬細胞的凋亡水平。結果: 小鼠被不同毒力的結核桿菌感染后其腹腔巨噬細胞中Mcl-1 mRNA和蛋白的表達水平均有不同程度的升高，其中以感染了強毒株和p7Rv的腹腔巨噬細胞升高最為明顯(P<0.05)；應用RNA干擾技術沉默Mcl-1基因后，Mcl-1 mRNA和蛋白的表達水平明顯低于對照組(P<0.05)；流式細胞術分析顯示，下調Mcl-1基因的表達可誘導小鼠腹腔巨噬細胞凋亡。結論: 應用Mcl-1-shRNA可有效沉默Mcl-1在感染了不同毒力結核桿菌小鼠腹腔巨噬細胞中的表達，并能上調巨噬細胞的凋亡水平。

[關鍵詞]結核分枝桿菌； Mcl-1基因； 腹腔巨噬細胞； RNA干擾； 細胞凋亡

結核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis，MTB)是典型的胞內致病菌，其能通過多種機制逃避機體免疫細胞的殺傷及清除，從而影響其宿主細胞(單核巨噬細胞)的調控，導致巨噬細胞不能正常凋亡[1]。髓樣細胞白血病1(myeloid cell leukemia-1，Mcl-1)基因隸屬于Bcl-2家族，其主要作用是抑制細胞凋亡，目前大量的研究表明，與Bcl-2家族其它成員相比，在表達Mcl-1基因的細胞中，其表達水平可能是決定細胞生存的關鍵因素[2]。因此本研究以Mcl-1基因作為支點，通過靶向沉默其表達，借以探討不同毒力結核桿菌感染小鼠后Mcl-1基因在宿主巨噬細胞凋亡中的調控作用和機制。

材料和方法

1菌株和實驗動物

結核分枝桿菌國際標準強毒株p7Rv、結核分枝桿菌國際標準無毒株p7Ra和卡介苗菌株(Bacillus Calmette-Guerin vaccine，BCG)由中國藥物生物制品檢定所提供；新疆地區流行的優勢強毒結核分枝桿菌臨床分離株由本實驗室前期鑒定并保存。實驗小鼠為8周齡SPF級(無特定病原體動物)雌性BALB/c小鼠，重(18±2) g，共192只，購于石河子大學實驗動物中心。

2主要試劑

Super RT cDNA Kit及TRIzol Reagent 購自Invitrogen；QuantiFast SYBR Green PCR Kit 購自Qiagen；無內毒素質粒大量抽提試劑盒購自TIANGEN；流式凋亡試劑盒(Annexin V-APC/7-AAD)購自聯科生物技術有限公司；小鼠Mcl-1蛋白ELISA試劑盒購自Cloud-Clone；兔多克隆抗體Mcl-1購自Santa Cruz；β-actin單克隆抗體、辣根過氧化物酶標記的山羊抗鼠IgG抗體及山羊抗兔IgG購自北京中衫金橋生物技術有限公司；ECL化學發光試劑盒購自Millipore。

3方法

3.1實驗分組將實驗小鼠隨機分為強毒株組、p7Rv組、p7Ra組、BCG組、強毒株+Mcl-1-shRNA組、p7Rv+Mcl-1-shRNA組、p7Ra+Mcl-1-shRNA組、BCG+Mcl-1-shRNA組、Mcl-1-shRNA組和空白對照組，在模型建立后的第1、3、5、7天設置4個時點，每組每個時點各設3只小鼠。

3.2小鼠感染模型的建立在生物安全柜內，以滅菌接種環取改良羅氏固體培養基上生長2～3周、狀態良好的結核桿菌菌落，置滅菌磨菌器中，加少量0.05% Tween-20 的生理鹽水充分研磨，使其成均勻渾濁的菌懸液。利用麥氏比濁法調細菌濃度約1.0×1010/L。將不同菌懸液經小鼠腹腔分別注射到對應分組的每只小鼠體內，注射量約為0.3 mL[3]。將感染小鼠置生物安全三級實驗室內，IVC籠具中飼養。

3.3小鼠腹腔巨噬細胞的收集在上述不同時點將小鼠脫頸處死，用75%乙醇消毒小鼠腹部皮膚，置于超凈臺中；用鑷子將小鼠下腹部皮膚提起，剪開一個小口，將皮膚撕開，完全暴露腹膜；用鑷子提起腹膜，用5 mL注射器向小鼠腹腔中注入5 mL 1640培養基，反復按摩腹部10 min，避開腸和脂肪，反復回抽腹腔液，不同的方向沖洗數次，最后吸出腹腔液；將細胞懸液1 200 r/min條件下離心5 min，棄上清，PBS液洗滌l次，用含10%胎牛血清的DMEM培養液將細胞懸起；將細胞接種到6孔細胞培養板中，置于37 ℃、5% CO2的培養箱中培養6 h,貼壁細胞即為小鼠腹腔巨噬細胞[4]。

3.4ELISA法篩選Mcl-1-shRNA最佳劑量及最佳處理時間按照質粒大量抽提試劑盒操作說明提取已篩選并構建好的Mcl-1-shRNA質粒[5]，隨機選取48只正常BALB/c小鼠，分為每只0 μg、50 μg、75 μg和100 μg 4個劑量組，同時設置1 d、3 d、5 d和7 d 4個時點，每組每個時點3只小鼠，將質粒DNA采用hydrodynamic技術注入各組小鼠體內[6]，在上述不同時點，分別提取培養各組小鼠的腹腔巨噬細胞，用細胞裂解液抽提小鼠腹腔巨噬細胞總蛋白，按照ELISA試劑盒操作說明進行操作，計算各組中Mcl-1蛋白含量。隨機選取24只BALB/c小鼠，在生物安全柜內經腹腔接種BCG菌懸液0.3 mL，于感染后的1 d、2 d、3 d、4 d、5 d、6 d、7 d、8 d分別提取培養小鼠的腹腔巨噬細胞，用細胞裂解液抽提小鼠腹腔巨噬細胞總蛋白，按照ELISA試劑盒操作說明進行操作，計算Mcl-1的蛋白含量。

3.5應用實時熒光定量PCR檢測Mcl-1的mRNA表達用TRIzol法分別提取各組小鼠腹腔巨噬細胞的總RNA，分光光度法測定并計算提取的總RNA含量及濃度，按照逆轉錄試劑盒操作說明將各組細胞總RNA逆轉錄成cDNA，參照QuantiFast SYBR Green PCR Kit試劑盒說明書進行實時定量PCR檢測Mcl-1的mRNA表達。PCR引物由上海生物工程公司合成，引物序列見表1。擴增條件為：95 ℃ 5 min；95 ℃ 10 s，57 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，共40個循環。應用2-ΔΔCt法對結果進行分析。

表1　引物序列

3.6應用Western blot檢測Mcl-1的蛋白表達用蛋白裂解液裂解小鼠腹腔巨噬細胞后分別提取各組細胞總蛋白，BCA法進行蛋白濃度測定及配平，10% SDS-PAGE分離蛋白質，半干電轉將蛋白轉移到PVDF膜上(23 V，40 min)，室溫封閉2 h，與1∶1 000 兔抗鼠Mcl-1多抗反應后，用辣根過氧化物酶標記的相應 II 抗孵育1 h，ECL法顯色壓片曝光，用凝膠成像儀分析系統對Western blot檢測條帶進行灰度值掃描，計算Mcl-1與β-actin吸光度比值，進行半定量統計學分析。

3.7應用Annexin V-APC/7-AAD凋亡試劑盒檢測細胞凋亡提取各組小鼠腹腔巨噬細胞，根據凋亡試劑盒操作說明進行操作，將收集的細胞用冷的PBS洗滌2次，用預冷的1×Binding Buffer重懸細胞調整細胞數至1×109/L，每管加入100 μL細胞，5 μL的Annexin V-APC和10 μL的7-AAD，混合后避光于冰上靜止30 min，最后每管加入400 μL預冷的1×Binding Buffer，30 min內上機檢測。

4統計學處理

數據以均數±標準差(mean±SD)表示，利用SPSS 17.0軟件處理數據，實驗所得數據資料進行單因素方差分析(one-way ANOVA)，應用SNK-q檢驗進行多個樣本均數間的兩兩比較，以P<0.05為差異有統計學意義。

結果

1Mcl-1-shRNA最佳劑量及最佳處理時間的篩選

ELISA法檢測結果顯示，與對照組相比，在3種質粒濃度作用下小鼠腹腔巨噬細胞Mcl-1蛋白的表達均有不同程度的下調(P<0.05)，其中每只75 μg和100 μg作用最為明顯，但二者差異無統計學意義，故以每只75 μg作為Mcl-1-shRNA作用的最佳劑量。小鼠予BCG菌懸液感染造模，在感染后第1天的Mcl-1蛋白已有表達，并呈上升趨勢，于第3天達高峰，隨后表達逐漸降低，故選擇Mcl-1蛋白表達水平最高的第3天為質粒開始作用的最佳時點，見圖1。

Figure 1.The protein levels of Mcl-1 in the mouse peritoneal macrophages treated with Mcl-1-shRNA at different concentrations (A) and infected with BCG (B) determined by ELISA. Mean±SD.n=3.*P<0.05vs0 μg;#P<0.05vs50 μg;△P<0.05vs75 μg;▽P<0.05vs100 μg.

圖1ELISA法檢測各組小鼠腹腔巨噬細胞內Mcl-1蛋白的表達

2Mcl-1 mRNA表達水平的測定

應用2-ΔΔCt法分析后結果顯示，與空白對照組相比，不同毒力結核桿菌感染的小鼠腹腔巨噬細胞Mcl-1 mRNA的表達水平均有不同程度的增高，其中以強毒株組和p7Rv組增高最為明顯(P<0.05)，p7Ra組和BCG組雖Mcl-1的mRNA水平有所上升，但與對照組相比差異不顯著，而Mcl-1的mRNA表達水平并未因作用時間的不同而表現出明顯差異。應用Mcl-1-shRNA質粒干預組與未用質粒干預的對照組相比，Mcl-1-shRNA質粒干預后各組Mcl-1的mRNA表達水平明顯下調，其中未感染組下調約80%，最為明顯(P<0.05)，感染了p7Ra和BCG的小鼠腹腔巨噬細胞分別下調約74%和75%(P<0.05)，感染了強毒株和p7Rv的小鼠腹腔巨噬細胞下調趨勢稍弱，分別下調約65%和70%(P<0.05)，見圖2。

Figure 2.Real time-PCR was used to determine the mRNA expression of Mcl-1 in the mouse peritoneal macrophages infected with different virulence ofMycobacteriumtuberculosisand treated with or without Mcl-1-shRNA. A: control group; B: BCG group; C: p7Ra group; D: p7Rv group; E: virulence strains of Xinjiang group; F: Mcl-1-shRNA group; G: Mcl-1-shRNA+BCG group; H: Mcl-1-shRNA+p7Ra group; I: Mcl-1-shRNA+p7Rv group; J: Mcl-1-shRNA+virulence strains of Xinjiang group. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsBCG group;△P<0.05vsp7Ra group;▽P<0.05vsp7Rv group;☆P<0.05vsvirulence strains of Xinjiang group.

圖2實時熒光定量PCR檢測Mcl-1的mRNA表達

3Mcl-1蛋白表達水平的測定

Western blot結果顯示，與空白對照組相比，不同毒力結核桿菌感染后小鼠腹腔巨噬細胞的Mcl-1蛋白表達水平均有不同程度的增高，其中以強毒株組和p7Rv組增高最為明顯(P<0.05),分別為對照組的4.32倍和3.63倍，p7Ra組和BCG組的Mcl-1蛋白表達與對照組相比差異不顯著，且Mcl-1蛋白的表達水平未因作用時間的不同而表現出明顯差異(P>0.05)。應用Mcl-1-shRNA質粒干預組與未用質粒干預的對照組相比，Mcl-1-shRNA質粒干預后各組Mcl-1蛋白的表達水平明顯下調，其中未感染組下調約67%(P<0.05)，感染了BCG組、p7Ra組、p7Rv組和強毒株組分別下調約77%、79%、57%和63%(P<0.05)，見圖3。

4Annexin V-APC/7-AAD細胞凋亡的檢測

流式細胞術檢測結果顯示，與空白對照組相比，感染了強毒株組、p7Rv組、p7Ra組和BCG組的小鼠腹腔巨噬細胞凋亡率均有不同程度的升高(P<0.05)，且以建模后第5天凋亡率最高(P<0.05)，其中p7Ra組和BCG組的凋亡率上升最為明顯，強毒株組和p7Rv組的上升程度稍弱。應用Mcl-1-shRNA質粒干預組與未用質粒干預的對照組相比，Mcl-1-shRNA質粒干預后各組細胞凋亡率明顯上調，其中以p7Ra組和BCG組上調程度最為明顯，強毒株組、p7Rv組次之，未感染組上調趨勢稍弱，見圖4、表2。

討論

細胞凋亡是機體在進化過程中形成的一種保守死亡方式，其在維持組織動態平衡、機體正常發育、排除受損或病毒感染的細胞中有著不可或缺的作用。早前研究發現結核分枝桿菌感染機體后，主要寄居存活在宿主巨噬細胞內，若宿主巨噬細胞發生凋亡，便可殺死寄生于其內的結核分枝桿菌，阻止其在體內繁衍播散，同時亦可將鄰近未感染的巨噬細胞激活，增強機體清除殺傷結核分枝桿菌的能力[7]。因此，宿主巨噬細胞的凋亡影響著結核分枝桿菌的命運。近年研究表明宿主巨噬細胞凋亡水平因其感染結核分枝桿菌毒力的不同而存在差異[8]，有毒的結核桿菌可通過多種機制阻止宿主細胞的凋亡，其中被廣泛研究的是增加可溶性TNF受體的活化、減少FasL的激活、誘導抗凋亡蛋白的表達來抑制宿主細胞的凋亡。

Figure 3.The protein expression of Mcl-1 in the mouse peritoneal macrophages infected with different virulence ofMycobacteriumtuberculosisand treated with or without Mcl-1-shRNA determined by Western blot. A: control group; B: BCG group; C: p7Ra group; D: p7Rv group; E: virulence strains of Xinjiang group; F: Mcl-1-shRNA group; G: Mcl-1-shRNA+BCG group; H: Mcl-1-shRNA+p7Ra group; I: Mcl-1-shRNA+p7Rv group; J: Mcl-1-shRNA+virulence strains of Xinjiang group. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsBCG group;△P<0.05vsp7Ra group;▽P<0.05vsp7Rv group;☆P<0.05vsvirulence strains of Xinjiang group.

圖3Western blot檢測Mcl-1蛋白的表達

Bcl-2家族在凋亡過程中起著重要的調控作用[9]，其由抗凋亡和促凋亡兩類基因組成。Mcl-1是Bcl-2家族中的抗凋亡基因，與Bcl-2有著類似的結構和功能,其作用主要是維持細胞線粒體膜的穩定、抑制細胞色素C的釋放、促進細胞的生存、抑制細胞的凋亡[10]。Mcl-1在多種細胞系的凋亡、分化和細胞周期調控中發揮著重要作用[11]，由于它的半衰期短，可快速對細胞內外環境因素的改變做出反應,因此被認為是細胞內最為重要的抗凋亡因子[12]。Sly等[13]早期發現THP-1細胞和來源于人單核細胞系的巨噬細胞在吞噬結核分枝桿菌毒力株p7Rv后，其Mcl-1的mRNA表達水平均明顯上調，并抑制了巨噬細胞的凋亡，用Mcl-1的mRNA反義寡脫氧核糖核酸處理后，被p7Rv感染的巨噬細胞的凋亡水平明顯升高。隨后有研究者用不同的細菌感染巨噬細胞，發現無論是長期的還是短暫的感染，巨噬細胞內Mcl-1的mRNA表達水平在感染前后均存在差異，并且這種表達的差異影響了巨噬細胞對細菌的清除[14]。

Figure 4.The apoptotic rates of the mouse peritoneal macrophages infected with different virulence ofMycobacteriumtuberculosisand treated with or without Mcl-1-shRNA analyzed by flow cytometry with Annexin V-APC/7-AAD staining.

圖4細胞凋亡檢測流式圖

表2　各組小鼠腹腔巨噬細胞的凋亡率

*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsBCG group;△P<0.05vsp7Ra group;▽P<0.05vsp7Rv group;☆P<0.05vsvirulence strains of Xinjiang group;▲P<0.05vs1 d;▼P<0.05vs3 d;★P<0.05vs5 d;＄P<0.05vs7 d.

目前對Mcl-1基因的研究主 要集中在腫瘤相關疾病中，Mcl-1高表達在多種腫瘤細胞系中， 并能阻礙腫瘤細胞凋亡， 對抗化療藥物的殺傷作用， 有研究者采用靶向沉默Mcl-1基因的方式， 通過RNA干擾技術下調腫瘤細胞中Mcl-1基因的表達，發現腫瘤細胞的凋亡率被顯著上調， 并且正常細胞未受到明顯影響[15]。基于以上研究結果，我們以動物體內實驗為主，探討不同毒力的結核桿菌感染在體內能否誘導Mcl-1基因的表達，并驗證RNA干擾技術能否下調感染巨噬細胞內Mcl-1基因的表達水平。本研究發現小鼠感染的結核桿菌毒力越強所誘導的Mcl-1mRNA和蛋白的表達水平越高，感染p7Ra和BCG菌株后雖可誘導Mcl-1的表達，但與空白對照組相比并無顯著差異，Mcl-1-shRNA質粒作用后明顯下調了各組細胞內Mcl-1的表達，其中感染p7Ra和BCG組下調趨勢明顯高于強毒株和p7Rv組，由此我們推測Mcl-1主要被毒力強的結核桿菌所誘導，Mcl-1-shRNA可有效抑制Mcl-1基因的表達。此外，為了更詳盡地探討Mcl-1對感染不同毒力結核桿菌小鼠腹腔巨噬細胞凋亡的影響，本研究檢測了各組細胞的凋亡率，結果發現結核桿菌毒力越強宿主巨噬細胞的凋亡率越低，這與早前的研究結果一致，Mcl-1-shRNA質粒作用后明顯上調了各組細胞的凋亡水平，且感染了p7Ra和BCG組比感染了強毒株和p7Rv組更能顯著地誘導宿主細胞的凋亡，并于第5天凋亡率最高，而Mcl-1的表達水平并未因作用時間的不同而出現差異，由此我們推測Mcl-1被毒力菌誘導可能是其一種抗凋亡機制；下調Mcl-1基因的表達可增強宿主巨噬細胞的凋亡水平； Mcl-1亦可能通過直接或間接影響其它抗凋亡途徑來調控宿主細胞的凋亡水平； Mcl-1的抗凋亡作用可能是結核桿菌在宿主細胞內生存以及衍生擴散的重要原因。

本研究發現寄居于宿主巨噬細胞內的結核桿菌可通過誘導抗凋亡基因Mcl-1的表達來遏止宿主細胞的凋亡，并且Mcl-1的表達水平與結核桿菌毒力的強弱有關。Mcl-1-shRNA可明顯沉默受結核桿菌感染的巨噬細胞內Mcl-1的表達，并上調宿主細胞的凋亡水平，由此闡明Mcl-1基因表達的高低影響著結核桿菌宿主細胞的凋亡，且有毒的結核桿菌所高表達的Mcl-1可能為其逃避宿主細胞的殺傷提供一個額外的保護。本研究為今后防治結核病提供了一個新方向，然而Mcl-1-shRNA作用在體內有無其它影響還有待進一步驗證，且結核病的發生發展由諸多因素影響，毒力株通過何種機制誘導Mcl-1的表達還需深入研究。

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*[基金項目]國家自然科學基金資助項目(No. 81202949; No. 81370381)；山東省自然科學基金聯合專項(No. ZR2014HL013)；山東省醫藥衛生科技發展計劃項目(No. 2013WSB31009)

▲并列第1作者

Effects ofMcl-1 silencing on apoptosis of mouse peritoneal macrophages infected with different virulence ofMycobacteriumtuberculosisWANG Fei-yu1,4, WANG Xin-min3, WANG Chan2,4, WANG Xiao-fang1,4, ZHANG Yu-qing1,4, WU Jiang-dong1,4, WU Fang1,4, ZHANG Wan-jiang1,4, ZHANG Le1,4

(1DepartmentofPathophysiology,2DepartmentofPathogenBiologyandImmunology,3DepartmentofUrinarySurgery,FirstAffiliatedHospital,4KeyLaboratoryofXinjiangEndemicandEthnicDiseasesCooperatedbyEducationMinistrywithXinjiangProvince,MedicalCollegeofShiheziUniversity,Shihezi832002,China.E-mail: 1257067540@qq.com)

[ABSTRACT]AIM: To investigate the effect of inhibiting Mcl-1 gene expression on apoptosis of mouse peritoneal macrophages infected with different virulence of Mycobacterium tuberculosis using a technique of RNA interference. METHODS: The BALB/c mice were infected with prepared bacterium of the virulence strains of Xinjiang, p7Rv, p7Ra and BCG. Mcl-1-shRNA was applied to the mouse model of infection, and the control groups were set up. On 1 d, 3 d, 5 d and 7 d, the mouse peritoneal macrophages were collected. The expression of Mcl-1 at mRNA and protein levels was determined by real-time PCR and Western blot. The apoptotic rate of peritoneal macrophages was analyzed by flow cytometry. RESULTS: The expression of Mcl-1 at mRNA and protein levels was up-regulated in the peritoneal macrophages from the mice infected with different virulence of Mycobacterium tuberculosis, and the cells from the mice infected with virulence strains of Xinjiang and p7Rv expressed higher level of Mcl-1 than the uninfected control cells (P<0.05). The expression of Mcl-1 at mRNA and protein levels was reduced by RNA interference as compared with control group (P<0.05). Inhibition of Mcl-1 expression induced apoptosis of peritoneal macrophages in the mice. CONCLUSION: The Mcl-1 expression at mRNA and protein levels in mouse peritoneal macrophages infected with different virulence of Mycobacterium tuberculosis was effectively suppressed by Mcl-1-shRNA, which can induce macrophage apoptosis.

[KEY WORDS]Mycobacterium tuberculosis; Mcl-1 gene; Peritoneal macrophages; RNA interference; Apoptosis

通訊作者△秦樹存 Tel： 0538-6237252; E-mail: shucunqin@hotmail.com； 姚樹桐 Tel： 0538-6225010; E-mail: yst228@126.com

[收稿日期]2015- 07- 03[修回日期] 2015- 07- 22

[文章編號](責任編輯： 陳妙玲， 羅森)1000- 4718(2015)12- 2202- 07

doi:10.3969/j.issn.1000- 4718.2015.12.014

[中圖分類號]R363.1

[文獻標志碼]A