去卵巢和性成熟期ICR雌性小鼠動情周期的觀察*

杜納納，　許丹丹，　黃莉莉

(黑龍江中醫(yī)藥大學藥學院，黑龍江 哈爾濱 150040)

?

去卵巢和性成熟期ICR雌性小鼠動情周期的觀察*

杜納納，許丹丹，黃莉莉△

(黑龍江中醫(yī)藥大學藥學院，黑龍江 哈爾濱 150040)

[摘要]目的： 觀察處于性成熟期和去卵巢ICR小鼠的動情周期特點。方法: ICR雌性小鼠分為正常對照組、假手術組和去卵巢組，術后第8天開始，連續(xù)12 d，每日9:00和16:00分別做2次陰道涂片，記錄并觀察各組小鼠外陰和陰道涂片細胞特征，規(guī)律動情周期發(fā)生率，動情周期天數(shù)和動情周期各期持續(xù)時間。結(jié)果: 正常對照組與假手術組動情周期特點表現(xiàn)相似，85%處于性成熟期的ICR小鼠呈規(guī)律動情周期，多數(shù)為6 d周期(83%)，少數(shù)為5 d動情周期(17%)；與5 d相比，6 d的動情期持續(xù)時間明顯增加(P<0.05)。5 d和6 d動情周期陰道涂片細胞特征在數(shù)量和種類略有所不同。去卵巢組小鼠約76%呈動情周期紊亂，表現(xiàn)為連續(xù)動情間期。結(jié)論: ICR雌性小鼠具有自身品系的動情周期特點。

[關鍵詞]ICR小鼠； 去卵巢； 動情周期； 陰道涂片

ICR雌性小鼠是醫(yī)學實驗中常用的實驗動物，處于性成熟期的雌性小鼠表現(xiàn)出生殖器官增生、退化的周期性變化，即動情周期。動情周期紊亂是反應性激素失調(diào)的敏感指標，故去卵巢小鼠可作為圍絕經(jīng)期動物模型。有關雌性小鼠動情周期特點尚缺乏系統(tǒng)性論述，而且我們在實驗中亦觀察到，在陰道涂片細胞特征以及動情周期天數(shù)方面，可能是基于動物品系和實驗操作方法等原因，實驗結(jié)果不盡一致。為此，本研究通過連續(xù)12 d對處于性成熟期和去卵巢ICR小鼠進行陰道組織涂片觀察，確定動情周期內(nèi)各期的外陰特征、持續(xù)時間和陰道涂片細胞特征，以及處于規(guī)律和無規(guī)律動情期小鼠的發(fā)生例數(shù)，以探討ICR雌性小鼠動情周期特點，為從事相關實驗研究提供數(shù)據(jù)參考。

材料和方法

1實驗材料

1.1動物ICR小鼠，雌性，7～8周齡，體重23～25 g，SPF級，由黑龍江中醫(yī)藥大學提供，動物許可證號為SCXK(黑)2013-004。

1.2實驗環(huán)境溫度(18～22 ℃)，濕度(70%～85%)，12 h明暗交替(光照7:00～19:00，黑暗19:00～7:00)。

1.3實驗儀器B-2 型光學顯微鏡由上海齊躍生物科技有限公司生產(chǎn)； 電熱恒溫鼓風干燥箱 DHG-9055為上海島韓實業(yè)有限公司產(chǎn)品。

1.4實驗試劑亞甲基藍25 g(天津市致遠化學試劑有限公司)，氫氧化鉀500 g(天津市瑞金特化學品有限公司)，生理鹽水 ，95%乙醇，蒸餾水。

2方法

2.1分組及手術96只ICR小鼠，隨機分成3組，分別為正常對照組(24只)、假手術組(24只)和去卵巢組(48只)。去卵巢組依照文獻方法[1]摘除雙側(cè)卵巢，縫合皮膚，術后恢復7 d；假手術組，僅摘除雙側(cè)卵巢旁同樣大小的脂肪團，術后恢復7 d。正常對照組未經(jīng)任何處理。

2.2美蘭染色液的配制稱取亞甲基藍0.6 g和氫氧化鉀0.01 g，溶于95%乙醇30 mL中，再加蒸餾水100 mL，攪拌均勻，備用。

2.3陰道涂片各組ICR小鼠術后第8天開始，于每日9:00和16:00分別做2次陰道涂片，連續(xù) 12天。每次涂片前，固定ICR小鼠并翻提尾巴露出陰門，記錄觀察其陰門開張、陰門黏膜顏色及外陰腫脹情況。

陰道涂片操作如下：左手按常規(guī)捉拿固定ICR小鼠，右手取一鈍頭吸管，吸入生理鹽水0.2 mL，輕輕插入陰道2～3 mm，反復抽吸2～3次，取出吸管，將滴管內(nèi)洗液滴于玻片上，鋪平，干燥，將干燥的載玻片置于美蘭染色液中，染色10 min，用蒸餾水從涂片邊緣慢慢沖洗剩余的美蘭溶液，切勿把細胞沖掉，并使之干燥，干燥后，在顯微鏡下觀察陰道涂片的細胞學變化[2]。

2.4數(shù)據(jù)處理規(guī)律動情周期的界定：動情周期內(nèi)各期變化的順序依次為動情前期，動情期，動情后期和動情間期，并呈周期性變化。動情周期內(nèi)各期持續(xù)時間的界定：以各期陰道涂片時間作為該期的起始時間，該期轉(zhuǎn)換為下期時的陰道涂片時間作為結(jié)束時間，間隔時間為持續(xù)時間。

3統(tǒng)計學處理

本實驗數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析使用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件完成。計量資料采用均數(shù)±標準差(mean±SD)表示，計量資料采用組間t檢驗，計數(shù)資料采用卡方檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié)果

1正常對照組和假手術組ICR小鼠呈規(guī)律動情周期變化的發(fā)生情況

與正常對照組相比，假手術組中ICR小鼠呈規(guī)律動情周期變化的發(fā)生例數(shù)無明顯差異。正常對照組和假手術組中平均約85%的ICR小鼠表現(xiàn)出規(guī)律的動情周期變化，見表1。

表1正常對照組和假手術組呈規(guī)律動情周期變化ICR小鼠的發(fā)生率

Table 1.Occurrence rate of regular estrous cycle of female ICR mice between normal group and sham operation group (n=24)

GroupThenumberofregularestrouscycleOccurrencerate(%)Normal2187.5Shamoperation2083.3

2正常對照組和假手術組ICR小鼠動情周期的外陰特征

通過對陰道涂片前ICR小鼠外陰情況觀察與陰道涂片確定的動情周期比對，正常對照組和假手術組動情周期各期外陰特征表現(xiàn)相似。動情前期，陰道口一般為微開張或閉合，陰門口呈粉色，陰門微皺襞、輕微紅腫。動情期，陰道口半開或全開張，陰門口呈紅色，皺襞明顯腫脹。動情后期，陰道口半開，陰門口呈蒼白色，陰門皺襞輕微腫脹。動情間期，陰道口緊閉，陰門口呈蒼白色，陰門皺襞無腫脹。由上述可見，動情周期內(nèi)各期外陰特征區(qū)分不甚明顯，僅通過外陰特征難以判定動情周期各期。

3正常對照組和假手術組ICR小鼠規(guī)律動情周期內(nèi)各期的持續(xù)時間

與正常對照組相比，假手術組ICR小鼠動情周期為5 d或6 d的發(fā)生率無顯著差異。ICR小鼠動情周期為5 d或6 d內(nèi)各期的持續(xù)時間兩組亦無顯著差異(P>0.05)。結(jié)果顯示，ICR小鼠的動情周期一般為5～6 d，且多數(shù)為6 d，比例達84%(P<0.05)，見表2。

表2正常對照組和假手術組ICR小鼠規(guī)律動情周期內(nèi)各期的持續(xù)時間以及5 d和6 d動情周期的比例

Table 2.Each stage duration of regular estrous cycle and the occurrence rate of 5 d and 6 d cycles in female ICR mice between normal group and sham operation group (Mean±SD.n=24)

GroupEstrouscycle(d)Occur-rencerate(%)EachstageofestrouscycleTimeofduration(h)Normal519Preoestrus10.45±2.31 Oestrus38.23±6.57 Metoestrus14.86±1.34 Diestrus54.28±15.34 681Preoestrus12.00±1.58 Oestrus52.60±5.37* Metoestrus18.40±6.07 Diestrus58.40±13.10Sham516Preoestrus11.67±1.53opera-tion Oestrus41.30±4.72 Metoestrus12.67±0.57 Diestrus52.67±6.43 684Preoestrus11.56±2.89 Oestrus55.19±8.59* Metoestrus15.31±5.35 Diestrus56.06±12.97

*P<0.05vs5 d.

4動情周期各期陰道涂片的細胞變化情況

5 d組和6 d組動情周期各期在細胞數(shù)量和種類方面都有所不同。動情前期和動情后期，5 d組和6 d組陰道涂片細胞表現(xiàn)相近。動情期，除了出現(xiàn)大量的角化細胞這種細胞類型外，與5 d組3種細胞共存相比，6 d組表現(xiàn)為2種細胞共存。動情間期，白細胞和有核上皮細胞共存，還可見少量角化細胞，見圖1、表3。

5去卵巢組ICR小鼠的外陰特征及涂片細胞特點

去卵巢組ICR小鼠陰道口大部分呈現(xiàn)陰道口緊閉、陰門口呈白色，皺襞無腫脹，也有個別小鼠出現(xiàn)陰門呈淺紅色，皺襞輕微紅腫現(xiàn)象，陰道涂片確定均為動情間期。ICR小鼠，手術去卵巢后，76%去卵巢小鼠呈無規(guī)律動情周期，表現(xiàn)為連續(xù)動情間期。與正常對照組或假手術組相比，動情間期涂片細胞主要為白細胞，且分布密集，少見有核上皮細胞。

討論

本實驗對ICR雌性小鼠動情周期特點進行了系統(tǒng)研究。實驗結(jié)果顯示，與正常對照組相比，假手術組術后恢復1周，手術應激對小鼠動情周期的天數(shù)、呈規(guī)律動情周期的動物發(fā)生率及動情周期內(nèi)各期的持續(xù)時間均無明顯影響。因此，有關動情周期的實驗設計中，可僅設立假手術組，而無須設立正常對照組，以避免實驗動物浪費。

Figure 1.The vaginal smear photograph of each stage of estrous cycle in mice (methylene blue staining, ×200).a: cornified epithelial cells； a*: dense cornified epithe-lial cells; b: nucleated epithelial cells； b*: dense nucleated epithelial cells; c: leucocytes； c*: dense leucocytes; (a): small cornified epithelial cells; (b): small nucleated epithelial cells; (c): small leucocytes.

圖1小鼠動情周期各階段陰道涂片

表3不同動情周期陰道涂片細胞變化情況

Table 3.The feature of vaginal smear cytology in each estrous cycle stage (n=24)

EstrouscyclePreoestrusOestrusMetoestrusDiestrus5dab*(c)a*/a*(bc)a*c(b)/abcc*b(a)6dab*(c)/aba*/a*(b)/a*(c)a*c(b)c*b(a)/c*(ab)

a: cornified epithelial cells； a*: dense cornified epithelial cells; b: nucleated epithelial cells； b*: dense nucleated epithelial cells; c:leucocytes； c*: dense leucocytes; (a): small cornified epithelial cells; (b): small nucleated epithelial cells; (c): small leucocytes.

陰道涂片法是判定小鼠動情周期的常用方法之一[3]，在實驗動物例數(shù)較多的情況下，盡管其操作相對簡單，但是仍會大幅度的增加實驗工作量。陰道涂片主要是從主觀上判斷，缺乏完全客觀標準，較適宜于動態(tài)觀察，另遇陰道感染時，亦可見大量白細胞，難以與動情間期的白細胞為主的情況相區(qū)別，出現(xiàn)假陰性現(xiàn)象。本實驗結(jié)果顯示，7～8周齡(體重23～25 g)ICR雌性小鼠約85%表現(xiàn)出規(guī)律的動情周期變化，ICR小鼠手術去卵巢后，約有76%去卵巢小鼠動情周期紊亂，表現(xiàn)為連續(xù)動情間期。為此，我們認為，如僅為篩選是否處于規(guī)律動情周期或動情周期紊亂，而不以考察動情周期動態(tài)變化為目的，可以考慮免去陰道涂片步驟。以往絕大多數(shù)文獻在方法學中論述，去卵巢小鼠出現(xiàn)動情周期紊亂，但具體表現(xiàn)未說明[4]。本實驗結(jié)果亦觀察到，去卵巢小鼠多數(shù)呈動情周期紊亂，主要表現(xiàn)為連續(xù)動情間期，涂片細胞主要為白細胞，無角化細胞，少見有核上皮細胞，與文獻報道一致[1,5]。

通過對陰道涂片前小鼠外陰情況觀察與陰道涂片確定的動情周期比對，小鼠動情周期各期，尤其是動情前期，動情間期和動情后期的外陰特征情況難以用肉眼區(qū)別，相比較之下，動情期可見明顯外陰特征，即陰門口顏色較紅，皺襞明顯腫脹。有文獻報道，通過外陰情況判斷動情周期中動情期，與陰道涂片相比較，有42%相之符合[3]。本實驗結(jié)果亦表明，僅通過外陰特征難以判定動情周期各期，需要結(jié)合陰道細胞涂片的方法來確定。

已有文獻報道，動情周期的長短及持續(xù)時間受到遺傳、飼養(yǎng)條件、應激等因素的影響[6-7]。因此有必要對不同品系的動情周期特點進行研究，以作為實驗參考。本實驗結(jié)果顯示，ICR小鼠動情周期多為6 d，也有的為5 d。與動情周期5 d的動情期持續(xù)時間相比，動情周期6 d的動情期持續(xù)時間明顯增加，可見ICR小鼠動情周期的長短主要取決于動情期的長短。另本實驗結(jié)果得出，動情前期持續(xù)時間相對較短，如果每天僅1次陰道涂片觀察，會錯失動情前期。

陰道涂片細胞通常分別為角化上皮、有核上皮細胞和白細胞，3種細胞形態(tài)較易區(qū)別[8]。本實驗結(jié)果顯示，動情前期，常見角化細胞和有核上皮細胞共存；動情期，可見大量角化細胞，亦可見少量有核上皮細胞或少量白細胞；動情后期，3種細胞共存，白細胞數(shù)量增多；動情間期，白細胞和有核上皮細胞共存，偶見少量角化細胞。動情周期各期細胞并存居多，這主要是因為小鼠動情周期的每個階段是連續(xù)的、逐漸變化的動態(tài)過程，所以陰道脫落的細胞也是逐漸轉(zhuǎn)變的，在動情周期各期轉(zhuǎn)變過程中，常常會出現(xiàn)過渡型細胞表現(xiàn)。在實驗過程中，我們亦觀察到，通過陰道涂片評判動情周期各期時，還需結(jié)合上次的陰道涂片結(jié)果，綜合進行分期判定。

綜上所述，ICR雌性小鼠具有其品系的自身的動情周期特點，動情周期多數(shù)為6 d，動情期的長短決定了動情周期的天數(shù)。去卵巢小鼠表現(xiàn)為動情周期紊亂，且發(fā)生率較高，可作為圍絕經(jīng)期動物模型。然而，有關ICR小鼠動情周期內(nèi)性激素水平的變化，還有待進一步研究。

[參考文獻]

[1]馬堃，李連達. 中醫(yī)藥治療更年期綜合征藥效學試驗的基本要求[J]. 中藥新藥與臨床藥理, 2005, 16(3):214-216.

[2]連小嬡，張均田，陳奇. 重復應激對生殖內(nèi)分泌功能的影響[J]. 中藥藥理與臨床, 1998, 14(增刊):3.

[3]何秋明，肖尚杰，夏慧敏. 大鼠陰道涂片的觀察[J]. 廣州醫(yī)學院學報, 2007, 35(4):54-56.

[4]Wise PM. Alterations in proestrous LH, FSH, and prolactin surges in middle-aged rats[J]. Proc Soc Exp Biol Med, 1982, 169(3):348-354.

[5]徐靜婷，曹亞麟，鄭文暉，等. 加減一陰煎改善去勢大鼠內(nèi)皮功能紊亂[J]. 中國病理生理雜志, 2015, 31(6):1008-1013.

[6]Nelson JF, Karelus K, Felicio LS, et al. Genetic in-fluences on oestrous cyclicity in mice: evidence that cycle length and frequency are differentially regulated[J]. Reprod Fertil, 1992, 94(1):261-268.

[7]vom Saal FS, Pryor S, Bronson FH. Effects of prior intrauterine position and housing on oestrous cycle length in adolescent mice[J]. Reprod Fertil, 1981, 62(1):33-37.

[8]張森，王新，韋旭斌，等. 大鼠發(fā)情周期各階段的陰道細胞變化觀察[J]. 動物醫(yī)學進展, 2006, 27(2):69-72.

(責任編輯： 林白霜， 羅森)

Observation of estrous cycle in sexual maturation and ovariectomized female ICR miceDU Na-na, XU Dan-dan, HUANG Li-li

(PharmaceuticalCollege,HeilongjiangUniversityofChineseMedicine,Harbin150040,China.E-mail: 908668195@qq.com)

[ABSTRACT]AIM: To observe the characteristics of estrous cycle of female ICR mice and ovariectomized mice that had reached sexual maturity stage. METHODS: ICR mice were randomly divided into 3 groups, normal group, sham operation group and ovariectomized group. After ovariectomy and sham operating, at the 8th day, the mice were taken vaginal smears twice daily (09:00 and 16:00) for 12 consecutive days. The feature of vulva in the mice and vaginal smear cytology, occurrence rate of regular estrous cycle, duration of estrous cycle and each stage duration of estrous cycle were recorded and observed. RESULTS: The characteristics of estrous cycle in normal group and sham operation group were similar. Nearly 85% of the ICR mice in sexual maturity stage showed regular estrous cycle. The majority manifested 6-day cycle (83%), and only a small number exhibited 5-day cycle (17%). Compared with 5-day group, the duration of oestrus was significantly increased in 6-day group (P<0.05). The number and kind of the cells in vaginal smear were a little different between 5-day and 6-day groups. The ovariectomized mice which showed irregular estrous cycle (76%) were characterized by continuous diestrus. CONCLUSION: Female ICR mice have the strain characteristics of estrus cycle.

[KEY WORDS]ICR mice; Ovariectomy; Estrous cycle; Vaginal smear

doi:10.3969/j.issn.1000- 4718.2015.12.033

[中圖分類號]R329.21

[文獻標志碼]A