四君子丸對(duì)Lewis肺癌小鼠腫瘤組織細(xì)胞caspase-3表達(dá)的影響

叢培瑋　王艷杰　趙丹玉　郭雋馥

(遼寧中醫(yī)藥大學(xué)教學(xué)實(shí)驗(yàn)中心生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室，遼寧　沈陽(yáng)　110847)

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四君子丸對(duì)Lewis肺癌小鼠腫瘤組織細(xì)胞caspase-3表達(dá)的影響

叢培瑋王艷杰1趙丹玉1郭雋馥

(遼寧中醫(yī)藥大學(xué)教學(xué)實(shí)驗(yàn)中心生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室，遼寧沈陽(yáng)110847)

摘要〔〕目的探討四君子丸對(duì)Lewis肺癌小鼠腫瘤組織細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白caspase-3表達(dá)的影響。方法在小鼠右側(cè)腋窩皮下，接種濃度為1×107個(gè)/ml的小鼠肺癌Lewis細(xì)胞懸液0.1 ml，模型建立成功后將小鼠分為L(zhǎng)ewis肺癌組、中藥治療組(成瘤后灌胃四君子丸0.093 6 g/10 g，1次/d，連續(xù)14 d)、順鉑組(腹腔注射0.05 mg/10 g，1次/w，持續(xù)2次)。采用透射電鏡觀察各組腫瘤組織細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化，采用Real-time PCR和免疫組化測(cè)定腫瘤組織caspase-3 mRNA及蛋白的表達(dá)水平。結(jié)果透射電鏡結(jié)果顯示：Lewis肺癌組細(xì)胞鏡下呈現(xiàn)出明顯惡性腫瘤細(xì)胞特征；中藥治療組鏡下可見腫瘤細(xì)胞以凋亡變化為主，大量凋亡細(xì)胞、凋亡小體及壞死細(xì)胞；順鉑組鏡下可見壞死細(xì)胞和典型凋亡細(xì)胞及凋亡小體。Real-time PCR及免疫組化結(jié)果共同顯示：和Lewis肺癌組比較，中藥治療組和順鉑組caspase-3 mRNA及蛋白表達(dá)水平顯著升高(P<0.01)。結(jié)論四君子丸能夠顯著提高Lewis肺癌小鼠模型腫瘤組織中caspase-3的表達(dá)，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡。

關(guān)鍵詞〔〕四君子丸；肺癌；凋亡；caspase-3

1遼寧中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)教研室

第一作者：叢培瑋(1981-)，女，博士，主要從事中醫(yī)藥對(duì)呼吸系統(tǒng)疾病防治的基礎(chǔ)研究。

研究發(fā)現(xiàn)〔1，2〕，含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(caspase)家族在多種腫瘤細(xì)胞的凋亡過(guò)程中表達(dá)下調(diào)，與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移有著密切的關(guān)系。caspase-3是caspase 家族中最重要的凋亡執(zhí)行者，負(fù)責(zé)全部或部分關(guān)鍵性蛋白的酶切，使胞質(zhì)、胞核及細(xì)胞骨架的重要蛋白酶失活，從而引發(fā)細(xì)胞凋亡。近期研究表明〔3〕，很多藥物可以通過(guò)調(diào)節(jié)caspase家族中caspase-3的蛋白表達(dá)調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡，從而達(dá)到抑制腫瘤生長(zhǎng)的作用。本研究依據(jù)中醫(yī)培土生金原理，運(yùn)用健脾益氣的四君子丸為干預(yù)措施，利用Lewis肺癌小鼠模型，觀察四君子丸對(duì)腫瘤組織中caspase-3基因和蛋白表達(dá)的影響。

1材料和方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物SPF級(jí)C57雄性小鼠32只，由常州卡文斯實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供〔生產(chǎn)許可證：SCXK(蘇)2011-0003；合格證編號(hào)：0024590，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證：SYXK(蘇)2012-010〕，日齡21～35 d；體重18～22 g。

1.2主要試劑和儀器四君子丸(湖北廣仁藥業(yè)有限公司，批號(hào)：120401)，順鉑(齊魯制藥有限公司，批號(hào)：1W2A1301004B)；TUNEL原位凋亡檢測(cè)試劑盒，RNAiso Plus 試劑盒，Real-time PCR試劑盒，SYBR Premix Ex Taq Ⅱ試劑盒(Takara公司)多聚賴氨酸溶液，Triton-X100(南京凱基生物科技發(fā)展有限公司)；二脒基-2-苯基吲哚(DAPI，福州邁新生物科技有限公司)；蘇木素染色液(南京建成生物工程研究所)；中性樹膠、二甲苯、甲醇、乙醇(中國(guó)國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)。THZ-312臺(tái)式恒溫振蕩器(上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)；101AS-3電熱鼓風(fēng)干燥箱(上海圣欣科學(xué)儀器有限公司)；JEM-100CXⅡ型透射電鏡(日本日立公司)。

1.3模型制備與評(píng)價(jià)收集體外培養(yǎng)的小鼠肺癌Lewis細(xì)胞，計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞懸液濃度為1×107個(gè)/ml，接種0.1 ml細(xì)胞懸液于小鼠右側(cè)腋窩皮下；待成瘤后用游標(biāo)卡尺測(cè)量移植瘤直徑，待腫瘤生長(zhǎng)至50 mm3，視為模型建立成功。

1.4實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組和給藥模型建立成功后隨機(jī)分為L(zhǎng)ewis肺癌組、中藥治療組、順鉑組，每組8只。同時(shí)開始給藥，給藥14 d后處死小鼠。四君子丸粉碎成粉末，利用蒸餾水配制成0.468 g/ml，中藥治療組：成瘤后灌胃四君子丸0.093 6 g/10 g，1次/d，連續(xù)14 d；順鉑組：腹腔注射0.05 mg/10 g，1次/w，持續(xù)2次。

1.5腫瘤重量的測(cè)定和腫瘤生長(zhǎng)抑制率的計(jì)算給藥14 d后處死小鼠，手術(shù)剝?nèi)×鰤K稱重。計(jì)算抗腫瘤活性的評(píng)價(jià)指標(biāo)：腫瘤生長(zhǎng)抑制率(%)，公式為(給藥組平均瘤重-模型對(duì)照組平均瘤重)/模型對(duì)照組平均瘤重×100%。

1.6采用透射電鏡觀察腫瘤生長(zhǎng)完整剝離瘤體，取材、固定、脫水、環(huán)氧樹脂Epon812浸透過(guò)夜，包埋，40℃、60℃各24 h常規(guī)聚合，LKB V超薄切片機(jī)切片，醋酸鈾、檸檬酸鉛雙染色，JEM-100CXⅡ型透射電鏡下觀察。

1.7采用Real-time PCR測(cè)定腫瘤組織caspase-3 mRNA表達(dá)水平給藥14 d后取腫瘤組織，RNAiso Plus 試劑盒提取組織細(xì)胞總RNA，紫外分光光度計(jì)檢測(cè)RNA純度：A260/A280 1.8～2.2。去除基因組DNA，反轉(zhuǎn)錄RT反應(yīng)和SYBR GreenⅠ法相對(duì)定量分析。反轉(zhuǎn)錄條件：37℃ 15 min，85℃ 5 s，4℃保存。實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)條件：95℃ 2 min，95℃ 30 s，60℃ 30 s，32個(gè)循環(huán)。caspase-3基因：上游引物5′-TGGACCTGTTGACCTGAAAA-3′，下游引物5′-ACAAAGCGACTGGATGAACC-3′；內(nèi)參照甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)基因：上游引物5′-GAGGACCAGGTTGTCTCCTG-3′，下游引物5′-GGATGGAATTGTGAGGGAGA-3′，引物由大連寶生物工程公司設(shè)計(jì)并合成。

1.8采用免疫組化測(cè)定腫瘤組織caspase-3蛋白表達(dá)水平溶液滅活酶室溫(15℃～25℃)封閉10 min，磷酸鹽緩沖液(PBS)浸洗。滴加即用型山羊血清50～100 μl 封閉，室溫孵育20 min。滴加一抗50～100 μl，37℃，濕盒孵育2 h，PBS浸洗。滴加增強(qiáng)劑50 μl，室溫濕盒孵育30 min。滴加通用型IgG抗體-Fab段-HRP多聚體50 μl，37℃，孵育30 min。PBS浸洗3次。每張片子加2滴新鮮配制的二氨基聯(lián)苯胺(DAB)溶液顯色。鏡下觀察染色深淺，染好立即終止，自來(lái)水輕柔沖洗15 min，用蒸餾水終止顯色反應(yīng)。復(fù)染10 min，用蒸餾水沖洗干凈，自來(lái)水沖洗后返藍(lán)。脫水封片。光學(xué)顯微鏡下觀察組織細(xì)胞中蛋白的表達(dá)情況，取3個(gè)高表達(dá)區(qū)域拍照保存。

1.9統(tǒng)計(jì)學(xué)方法應(yīng)用SPSS18.0軟件，數(shù)據(jù)組間比較采用單因素方差分析，采用雙變量簡(jiǎn)單分析法測(cè)定變量間的相關(guān)性。

2結(jié)果

2.1四君子丸對(duì)Lewis肺癌小鼠腫瘤重量和抑瘤率的影響與Lewis肺癌組〔(3.52±0.65)g〕比較，中藥治療組〔(2.07±0.43)g〕和順鉑組〔(2.09±0.35)g〕腫瘤重量顯著降低(P<0.01)，中藥治療組抑瘤率達(dá)到41.15%，順鉑組抑瘤率達(dá)到40.65%。

2.2四君子丸對(duì)Lewis肺癌小鼠腫瘤形態(tài)學(xué)的影響電鏡結(jié)果顯示：Lewis肺癌組細(xì)胞呈現(xiàn)出惡性腫瘤細(xì)胞特征，生長(zhǎng)旺盛，腫瘤細(xì)胞大小不一，細(xì)胞核大、深染，核漿比例失調(diào)，核異形性明顯，細(xì)胞膜完整，胞質(zhì)內(nèi)線粒體腫脹明顯，偶見粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，散在核糖體顆粒，可見巨核細(xì)胞。中藥治療組：鏡下可見腫瘤細(xì)胞以凋亡變化為主，有的呈現(xiàn)出細(xì)胞凋亡早期的特點(diǎn)，腫瘤細(xì)胞大小不一，細(xì)胞體積明顯縮小，核膜稍擴(kuò)張，核形不規(guī)整，核內(nèi)異染色質(zhì)增多、邊集，濃縮成團(tuán)塊狀或新月狀，分布在核膜的內(nèi)側(cè)，而細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)完整，還有部分細(xì)胞固縮核裂解，形成許多細(xì)胞小體，即凋亡小體，由膜包繞，小體內(nèi)可見核的殘片及胞質(zhì)。順鉑組：鏡下可見壞死細(xì)胞和典型凋亡細(xì)胞及凋亡小體，壞死細(xì)胞體積異常增大，核大畸變，細(xì)胞大小不一，較多的凋亡細(xì)胞，可見少量壞死及炎細(xì)胞浸潤(rùn)。見圖1。

圖1　四君子丸對(duì)Lewis肺癌小鼠腫瘤組織細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的影響(×200)

2.3四君子丸對(duì)Lewis肺癌小鼠腫瘤組織細(xì)胞caspase-3 mRNA表達(dá)的影響與Lewis肺癌組(0.73±0.17)比較，中藥治療組(1.24±0.27)和順鉑組(1.31±0.24)caspase-3 mRNA表達(dá)水平顯著增加(P<0.01)。

2.4四君子丸對(duì)Lewis肺癌小鼠腫瘤組織細(xì)胞caspase-3蛋白表達(dá)的影響免疫組化結(jié)果顯示，腫瘤組織中caspase-3陽(yáng)性細(xì)胞為棕色。與Lewis肺癌組(4 603.17±244.03)比較，中藥治療組(13 203.93±113.72)和順鉑組(14 870.60±653.00)caspase-3陽(yáng)性細(xì)胞顯著增多，平均光密度值顯著增加(P<0.01)。見圖2。

圖2　四君子丸對(duì)Lewis肺癌小鼠腫瘤組織細(xì)胞caspase-3蛋白表達(dá)的影響(×40)

3討論

目前，國(guó)內(nèi)外針對(duì)腫瘤防治機(jī)制的研究〔4〕主要集中在三大領(lǐng)域：免疫抑制、抗凋亡及耐藥。細(xì)胞凋亡被稱為程序性細(xì)胞死亡，正常細(xì)胞凋亡受阻，細(xì)胞增殖與凋亡的平衡調(diào)節(jié)被破壞，細(xì)胞凋亡率下降。一旦機(jī)體不能重新恢復(fù)這種平衡，細(xì)胞數(shù)目將不斷增加，表現(xiàn)出生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)，而這種惡性細(xì)胞無(wú)限增殖是腫瘤發(fā)生的重要機(jī)制之一〔5〕。研究表明細(xì)胞凋亡的途徑主要有三種〔6〕：第一種是線粒體途徑，第二種是死亡受體途徑，第三種是通過(guò)凋亡誘導(dǎo)因子實(shí)現(xiàn)凋亡。前兩條凋亡通路均需通過(guò) caspase通路完成。caspase-3是caspase通路中最重要的蛋白酶，是多種凋亡途徑的共同下游效應(yīng)部分，是細(xì)胞凋亡蛋白酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)的必經(jīng)之路〔7〕。趙陽(yáng)等〔8〕發(fā)現(xiàn)，在肺癌組織中存在凋亡下調(diào)的變化，caspase-3可能在肺癌的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要的作用。郭文峰〔9〕發(fā)現(xiàn)，與正常肺組織比較，caspase-3蛋白、基因表達(dá)水平在非小細(xì)胞肺癌組織中顯著上調(diào)，觀察caspase-3表達(dá)有助于臨床正確制訂初始化療方案和判斷預(yù)后。Sikdar等〔10〕發(fā)現(xiàn)CGS可能通過(guò)激活caspase-3的表達(dá)促進(jìn)細(xì)胞凋亡、壞死。Jiang等〔11〕發(fā)現(xiàn)與正常肺組織比較，caspase-3蛋白的表達(dá)在非小細(xì)胞肺癌裸鼠肺組織中顯著上調(diào)，caspase-3表達(dá)與腫瘤的惡性程度呈正相關(guān)。

無(wú)論中藥新藥作為單獨(dú)治療用藥還是聯(lián)合現(xiàn)代常規(guī)治療，或是化療、放療、靶向等現(xiàn)代常規(guī)治療后的中藥維持治療，其臨床定位都是要發(fā)揮其臨床價(jià)值。中醫(yī)認(rèn)為脾虛氣血生化乏源、氣血運(yùn)行不暢，氣虛血滯，壅阻經(jīng)絡(luò)臟腑，遂可結(jié)成腫瘤。脾胃為土，肺為金，土生金，脾虛及肺，虛則補(bǔ)其母。現(xiàn)代研究〔12〕發(fā)現(xiàn)，四君子丸(宋·《太平惠民和劑局方》)運(yùn)用中醫(yī)培土生金原理即補(bǔ)脾益肺法可顯著改善肺癌惡病質(zhì)諸多癥狀。方中人參性甘大補(bǔ)脾胃之氣，為君藥；白術(shù)苦溫，助君藥燥濕健脾，為臣藥；茯苓甘淡，滲濕利尿，為佐藥；炙甘草甘平，和中益氣，為使藥。四藥相輔，具有益氣健脾補(bǔ)肺之功效。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：中藥治療組可顯著增加caspase-3 mRNA和蛋白的表達(dá)，從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。 順鉑是一種類烷化劑的金屬鉑類化合物，也是廣泛用于肺癌化學(xué)治療的一線藥物，其作用機(jī)制通常認(rèn)為是通過(guò)與癌細(xì)胞的DNA結(jié)合形成交叉鏈，從而破壞DNA的功能，阻止DNA的復(fù)制。另?yè)?jù)文獻(xiàn)〔13〕報(bào)道，順鉑可以通過(guò)細(xì)胞特異性caspase-3依賴的信號(hào)途徑誘導(dǎo)凋亡的發(fā)生，從而發(fā)揮殺瘤效應(yīng)。

化療是肺癌綜合治療的重要手段之一，但由于肺癌細(xì)胞內(nèi)在的和(或)獲得性多藥抗藥性(MDR)的形成，使抗癌藥物對(duì)其化療的療效下降，往往導(dǎo)致化療失敗。有研究〔3〕表明，凋亡受阻是腫瘤細(xì)胞的另一生物學(xué)特性，多種藥物耐藥均與凋亡作用抑制有關(guān)。抵抗抗腫瘤藥物誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡可能是肺癌細(xì)胞MDR的本質(zhì)之一。順鉑作為肺癌的一線化療藥物，其療效呈明顯劑量依賴性，但嚴(yán)重的腎毒性限制了劑量的增加，且易產(chǎn)生耐藥。由于順鉑耐藥的存在造成肺癌患者5 年生存率的降低。因此在最大限度發(fā)揮化療的療效，并盡量降低其毒性，同時(shí)逆轉(zhuǎn)肺癌對(duì)順鉑的耐藥是當(dāng)前研究的熱點(diǎn)。有研究〔15〕表明，一些中藥的有效成分具有誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的作用，中西醫(yī)結(jié)合能有效治療惡性腫瘤，同時(shí)能減輕放化療的不良反應(yīng)。

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〔2014-12-19修回〕

(編輯袁左鳴)

Effects of sijunzi bolus on expression of caspase-3 in tumor cell of Lewis lung cancer mice

CONG Pei-Wei，WANG Yan-Jie，ZHAO Dan-Yu，etal.

Biotechnology Laboratory，Teaching and Experiment Center，Liaoning University of Traditional Chinese Medicine，Shenyang 110847，Liaoning，China

【Abstract】ObjectiveTo observe the effect of sijunzi bolus on the expression of caspase-3 of the Lewis lung carcinoma mice.MethodsTo vaccinate the 1×107/ml suspension liquid of Lewis lung carcinoma on the right side of mice axillary, then the successful models were divided into Lewis lung cancer, Chinese medicine treatment(sijunzi pill 0.093 6 g/10 g, once a day, 14 d),cisplatin group(0.05 mg/g,once a week, 2 times).To observe the morphology of apoptosis cell by transmission electron microscope, and the capacity of caspase-3 mRNA and protein levels were tested by real-time PCR and immunohistochemical respectively.ResultsLewis lung cancer groups presented the characteristics of malignant tumor cells. Apoptosis cells,apoptotic bodies, death cells were expressed significantly in Chinese medicine treatment group and the similar situation were seen in cisplatin group. The expression level of caspase 3 were significantly increased at both mRNA and protein compared with those of Lewis lung cancer group(P<0.01).ConclusionsSijunzi bolus might effectively increase the caspase 3 expression of the tumor tissue, thereby promote tumor cells apoptosis.

【Key words】Sijunzi bolus； Lung cancer；Apoptosis；caspase-3

通訊作者：王艷杰(1976-)，女，副教授，主要從事中醫(yī)藥對(duì)呼吸系統(tǒng)疾病防治的基礎(chǔ)研究。

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No.81202789)；遼寧省教育廳高等學(xué)校科研資助項(xiàng)目(No.2009A500)；遼寧省博士啟動(dòng)基金資助項(xiàng)目(No.20111134)

中圖分類號(hào)〔〕R273〔

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼〕A〔

文章編號(hào)〕1005-9202(2015)23-6644-03；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2015.23.002