1型糖尿病大鼠心肌纖維化中微血管內(nèi)皮細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)分化的鑒定

黃　俊　張明霞　黃江燕　萬　歡

(南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院心內(nèi)科，江西　南昌　330006)

?

1型糖尿病大鼠心肌纖維化中微血管內(nèi)皮細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)分化的鑒定

黃俊張明霞1黃江燕萬歡

(南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院心內(nèi)科，江西南昌330006)

摘要〔〕目的鑒定鏈脲佐菌素(STZ)誘導(dǎo)的1型糖尿病大鼠心肌纖維化中是否發(fā)生了心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞-間質(zhì)轉(zhuǎn)分化。方法STZ誘導(dǎo)大鼠心肌纖維化，12 w超聲心動圖檢測大鼠心功能指標(biāo)，VG染色觀察心肌組織膠原含量變化，免疫組化鑒定心肌組織中微血管內(nèi)皮細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)分化。結(jié)果心臟超聲提示實(shí)驗(yàn)組大鼠左室前后壁厚度(LVWT)、左室舒張末期內(nèi)徑(LVEDD)、左室收縮末期內(nèi)徑(LVESD)明顯大于對照組，左室射血分?jǐn)?shù)(LVEF)和左室短軸縮短率(FS)明顯小于對照組(P<0.05)。心肌VG染色實(shí)驗(yàn)組粉紅色膠原組織增多，而對照組僅有少許紅色膠原組織表達(dá)。心肌免疫組化染色觀察，實(shí)驗(yàn)組與對照組CD31、α-平滑肌肌動蛋白(SMA)均表達(dá)陽性，但實(shí)驗(yàn)組CD31表達(dá)減弱(P<0.05)、微血管壁α-SMA表達(dá)增強(qiáng)(P<0.05)。免疫酶雙染技術(shù)檢測，對照組微血管內(nèi)皮被染為棕黃色，實(shí)驗(yàn)組微血管內(nèi)皮紅色染色較強(qiáng)，而棕黃色較弱。結(jié)論STZ誘導(dǎo)的1型糖尿病大鼠心肌纖維化過程中發(fā)生了心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞-間質(zhì)轉(zhuǎn)分化。

關(guān)鍵詞〔〕糖尿病；內(nèi)皮細(xì)胞；間質(zhì)轉(zhuǎn)分化

1杭州市蕭山區(qū)第二醫(yī)院內(nèi)科

第一作者：黃俊(1968-)，男，醫(yī)學(xué)博士，主任醫(yī)師，教授，碩士生導(dǎo)師，主要從事冠心病防治及介入治療研究。

糖尿病心肌纖維化在糖尿病心肌病、心力衰竭的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用。成纖維細(xì)胞過度增殖活化、細(xì)胞外基質(zhì)大量產(chǎn)生過度沉積是心肌纖維化的主要原因。針對成纖維細(xì)胞的來源，源頭控制纖維化的發(fā)生發(fā)展，開始引起人們的興趣。研究發(fā)現(xiàn)微血管內(nèi)皮細(xì)胞-間質(zhì)轉(zhuǎn)分化(EndMT)途徑可生成大量的成纖維細(xì)胞、肌纖維母細(xì)胞〔1，2〕。本研究擬建立1型糖尿病大鼠心肌纖維化模型，鑒定其中是否發(fā)生了EndMT現(xiàn)象。

1材料與方法

1.1材料30只雄性SD大鼠，體質(zhì)量(170±5.85)g，隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組和對照組，每組15只。實(shí)驗(yàn)動物按照南昌大學(xué)醫(yī)學(xué)院動物倫理委員會規(guī)定執(zhí)行。鏈脲佐菌素(STZ)；血糖儀(強(qiáng)生穩(wěn)豪)；GE VIVI7超聲診斷系統(tǒng)(探頭頻率12 MHz，美國)；α-平滑肌肌動蛋白(SMA)、CD31抗體(博士德)；免疫組化Elivision plus試劑盒(福州脈新生物)；Polymer雙染檢測試劑盒(北京中杉金橋生物)。

1.2方法

1.2.1建立大鼠糖尿病心肌纖維化模型實(shí)驗(yàn)組大鼠單次腹腔注射STZ(60 mg/kg)制作1型糖尿病心肌纖維化模型。對照組腹腔注射等量檸檬酸緩沖液。STZ注射后72 h，尾靜脈采血測隨機(jī)血糖，剔除血糖<16.7 mmol/L大鼠。每周測大鼠體質(zhì)量、血糖1次，血糖≥16.7 mmol/L即認(rèn)為模型建立成功。

1.2.2心臟功能檢測建模后12 w超聲心動圖檢測。大鼠麻醉固定仰臥略向左傾斜位后獲取胸骨旁左室長軸切面二維及M型超聲圖像，測量左心室射血分?jǐn)?shù)(LVEF)，左室前、后壁厚度(LVWT)，左室舒張末期內(nèi)徑(LVEDD)，左室收縮末期內(nèi)徑(LVESD)和左心室短軸縮短率(FS)。

1.2.3心肌VG染色組織學(xué)檢查麻醉、處死大鼠，取左心室心肌組織，10%PBS中性甲醛固定，脫水、透明、石蠟包埋后制成切片，VG染色觀察心肌組織膠原含量變化，Image-Pro Plus 4.0圖像分析系統(tǒng)測量心肌組織膠原容積分?jǐn)?shù)(CVF)=膠原面積/總面積。

1.2.4免疫酶組化鑒定EndMTElivison二步法：切片按免疫組化常規(guī)處理，微波法修復(fù)抗原，分別加入小鼠來源的α-SMA一抗和兔來源的CD31一抗，并設(shè)陰性對照，每張切片加1滴酶標(biāo)抗鼠/兔聚合物；顯色，蘇木素襯染，脫水、透明、封片。顯微鏡觀察并拍照。Polymer雙染檢測：切片脫蠟和水化方法同Elivison二步法，微波法修復(fù)抗原，加入足量的兩種一抗混合物(小鼠來源的α-SMA一抗和兔來源的CD31一抗)于切片上，同時設(shè)陰性對照，每張切片加入50～100 μl 混合二抗，鏡下觀察顯色情況，蘇木素復(fù)染，自來水沖洗，放入PBS中返藍(lán)，滴加封片劑。顯微鏡觀察并拍照。

1.3統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)。

2結(jié)果

2.1兩組大鼠生存率、血糖、心臟功能及心肌組織學(xué)改變實(shí)驗(yàn)組與對照組大鼠生存率分別為93.3%和100%；實(shí)驗(yàn)組大鼠血糖均>16.7 mmol/L，對照組在5.6～7.4 mmol/L。超聲檢測實(shí)驗(yàn)組大鼠LVWT、LVEDD和LVESD明顯大于對照組；LVEF和左心室FS明顯小于對照組(P<0.05)(表1)。心肌VG染色實(shí)驗(yàn)組粉紅色膠原組織增多，對照組黃色心肌組織內(nèi)僅有少許粉紅色膠原組織表達(dá)；膠原半定量分析：對照組CVF(1.93±0.45)%明顯少于實(shí)驗(yàn)組CVF〔(8.35±1.02)%，P<0.05〕。

2.2Elivison二步法結(jié)果比較光學(xué)顯微鏡觀察封片，Image-Pro Plus 4.0圖像分析系統(tǒng)計算機(jī)讀片，以陽性染色區(qū)域的積分光密度值做半定量分析。實(shí)驗(yàn)組與對照組CD31均表達(dá)陽性，但實(shí)驗(yàn)組CD31表達(dá)減弱(P<0.05)。實(shí)驗(yàn)組與對照組α-SMA均表達(dá)陽性，但實(shí)驗(yàn)組心肌組織微血管壁α-SMA表達(dá)增強(qiáng)(P<0.05)(表2)，提示實(shí)驗(yàn)組中微血管內(nèi)皮細(xì)胞性質(zhì)已向間質(zhì)樣細(xì)胞轉(zhuǎn)化。

組別LVEF(%)LVWT(cm)LVEDD(cm)LVESD(cm)左心室FS(%)對照組87±2.30.15±0.010.55±0.020.25±0.0155±1.78實(shí)驗(yàn)組63±2.21)0.20±0.011)0.69±0.021)0.45±0.021)32±1.321)

與對照組比較：1)P<0.05，下表同

組別α-SMACD31對照組3.2137±0.15262.3264±0.2769實(shí)驗(yàn)組8.2256±0.14361)1.4384±0.17981)

2.3Polymer雙染檢測結(jié)果對照組微血管內(nèi)皮被染為棕黃色，而實(shí)驗(yàn)組微血管內(nèi)皮紅色染色較強(qiáng)，黃色染色較弱(圖1)。提示實(shí)驗(yàn)組中微血管內(nèi)皮細(xì)胞已發(fā)生間質(zhì)轉(zhuǎn)分化。

圖1　光學(xué)顯微鏡觀察各組大鼠心肌細(xì)胞橫切面Polymer雙染色(×40)

3討論

糖尿病心肌纖維化是糖尿病嚴(yán)重并發(fā)癥之一，在糖尿病心肌病、心力衰竭的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用。心肌成纖維細(xì)胞占心肌細(xì)胞總數(shù)的60%～70%，病理?xiàng)l件下由自身增殖及骨髓來源而過度增殖活化，過度產(chǎn)生細(xì)胞外基質(zhì)在心肌纖維化中發(fā)揮作用〔3〕。近來發(fā)現(xiàn)成纖維細(xì)胞除上述來源，EndMT途徑也生成大量的成纖維細(xì)胞、肌纖維母細(xì)胞〔1〕。

EndMT是由于炎癥因子、機(jī)械損傷、缺氧等刺激微血管內(nèi)皮細(xì)胞，使細(xì)胞間緊密連接破壞，喪失黏附特性從基底膜脫落，胞質(zhì)內(nèi)細(xì)胞骨架重排，表達(dá)α-SMA、成纖維細(xì)胞特異蛋白-1等表型蛋白，胞質(zhì)內(nèi)肌絲從上皮型的角蛋白轉(zhuǎn)變?yōu)殚g質(zhì)細(xì)胞的波形蛋白，細(xì)胞形態(tài)由卵石狀變成梭形，類似成纖維細(xì)胞、肌纖維母細(xì)胞，并具備相應(yīng)的功能，在組織器官的纖維化進(jìn)程中發(fā)揮作用〔4〕。Zeisberg等〔5〕用STZ誘導(dǎo)的小鼠糖尿病腎病模型中，幾乎30%～50%的成纖維細(xì)胞同時表達(dá)內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志CD31和成纖維細(xì)胞、肌成纖維細(xì)胞標(biāo)志人纖維母細(xì)胞素面抗原(FSP)-1、α-SMA，提示某些病理情況下EndMT來源的成纖維細(xì)胞占到了某些組織器官成纖維細(xì)胞總數(shù)的1/3～1/2。

本實(shí)驗(yàn)提示實(shí)驗(yàn)組內(nèi)皮細(xì)胞性質(zhì)樣細(xì)胞減少，微血管內(nèi)皮細(xì)胞已向成纖維樣細(xì)胞轉(zhuǎn)化。Polymer雙染檢測試劑盒檢測發(fā)現(xiàn)，對照組微血管內(nèi)皮被染為棕黃色，而實(shí)驗(yàn)組微血管內(nèi)皮紅色染色較強(qiáng)，黃色染色較弱，進(jìn)一步表明對照組微血管內(nèi)皮細(xì)胞未發(fā)生間質(zhì)轉(zhuǎn)分化；而實(shí)驗(yàn)組中微血管內(nèi)皮細(xì)胞已發(fā)生間質(zhì)轉(zhuǎn)分化，說明在STZ誘導(dǎo)的1型糖尿病大鼠心肌纖維化中，EndMT現(xiàn)象也同樣存在。而通過EndMT途徑生成的成纖維細(xì)胞在細(xì)胞外基質(zhì)代謝中的作用有待于進(jìn)一步研究。

參考文獻(xiàn)4

1Iwano M,Plieth D,Danoff TM,etal.Evidence that fibroblasts derive from epithelium during tissue fibrosis〔J〕.J Clin Invest,2002；110(3)：341-50.

2Zeisberg EM，Tarnavski O，Zeisberg M，etal.Endothelial-to-mesenchymal transition contributes to cardiac fibrosis〔J〕.Nat Med,2007；13(8)：952-61.

3Krenning G，Zeisberg EM，Kalluri R.The origin of fibroblasts and mechanism of cardiac fibrosis〔J〕.J Cell Physiol,2010；225(3)：631-7.

4Willis BC，duBois RM，Borok Z.Epithelial origin of myfibroblasts during fibrosis in the lung〔J〕.Proc Am Thorac Soc,2006;3(4)：377-82.

5Zeisberg EM，Potenta SE，Sugimoto H，etal.Fibroblasts in kidney fibrosis emerge via endothelial to mesenchymal transition〔J〕.J Am Soc Nephrol,2008；19(12)：2282-7.

〔2014-07-20修回〕

(編輯安冉冉/曹夢園)

基金項(xiàng)目：江西省自然科學(xué)基金(20132BAB205034)；江西省教育廳資助項(xiàng)目(GJJ12059)

中圖分類號〔〕R587〔

文獻(xiàn)標(biāo)識碼〕A〔

文章編號〕1005-9202(2015)23-6653-03；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2015.23.005