三苦滴丸抗實驗性大鼠心肌缺血作用的炎癥機制

鄒　迪　隋殿軍

(長春中醫藥大學附屬醫院腎病科，吉林　長春　130021)

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三苦滴丸抗實驗性大鼠心肌缺血作用的炎癥機制

鄒迪隋殿軍1

(長春中醫藥大學附屬醫院腎病科，吉林長春130021)

摘要〔〕目的觀察三苦滴丸(SK)對鹽酸異丙腎上腺素所致大鼠心肌缺血的保護作用相關炎性機制。方法將大鼠隨機分為6組，空白組、模型組給予0.9%氯化鈉注射液10 ml/kg，陽性對照組給予復方丹參滴丸405 mg/kg灌胃。SK高劑量組予SK 1 600 mg/kg灌胃，SK中劑量組予SK 800 mg/kg灌胃，SK 低劑量組予SK 400 mg/kg灌胃，共給藥10 d。連續3 d腹腔注射鹽酸異丙腎上腺素5 mg/kg。第8、9天給予腹腔注射鹽酸異丙腎上腺素(5 mg/kg)，空白組給予等容量生理鹽水。于第10天灌藥后30 min，各組大鼠分別以 10%烏拉坦(0.5 ml/100 g體重)麻醉，仰位固定，腹腔注射鹽酸異丙腎上腺素(5 mg/kg)，空白組給予等容量的生理鹽水。造模成功后2 h腹主動脈采血，檢測白細胞介素(IL)-1、IL-6、腫瘤壞死因子(TNF)α、血管細胞黏附因子(VCAM)-1；處死大鼠，取心臟，處理后行顯微鏡觀察；觀察SK對心肌細胞中1κB蛋白、NF-κBp65蛋白表達、NF-κB活性、NF-κBp65 mRNA基因表達的影響。結果不同劑量SK可不同程度減輕心肌缺血的程度，阻斷心肌缺血炎癥機制。結論SK對鹽酸異丙腎上腺素所致大鼠心肌缺血有良好的保護作用，可能與相關炎性機制有關。

關鍵詞〔〕三苦滴丸；心肌缺血；白細胞介素-1；白細胞介素-6；腫瘤壞死因子-α；血管細胞黏附因子-1

1吉林省衛生計生委

第一作者：鄒迪(1980-)，女，主治醫師，主要從事心血管病、腎病研究。

三苦滴丸(SK)以苦碟子為主藥，三七為輔藥。三七及苦碟子單用對于心腦血管疾病均有顯著療效。本實驗旨在探討SK對心肌缺血模型大鼠血清白細胞介素(IL)-1、IL-6、腫瘤壞死因子(TNF)α、血管細胞黏附因子(VCAM)-1、心肌組織結構、心肌核轉錄因子(NF)-κB活性、NF-κBp65 mRNA基因和蛋白表達的影響，為進一步研究SK抗心肌缺血作用的相關炎癥機制提供實驗依據。

1材料與方法

1.1實驗動物健康Wistar大鼠100只，雌雄各半，體重(200±20)g，由吉林大學白求恩醫學院動物實驗中心提供；飼料為實驗動物顆粒飼料，由長春市億斯實驗動物技術有限責任公司生產。

1.2主要試劑烏拉坦(氨基甲酸乙酯)，中國醫藥(集團)上海化學試劑公司，生產批號20001121；鹽酸異丙腎上腺素，上海禾豐制藥有限公司，產品批號110401；SK，長春中醫藥大學中醫藥與生物工程研發中心；復方丹參滴丸，天津天士力制藥股份有限公司，生產批號110516；IL-1、IL-6、TNF-α、VCAM-1試劑盒：美國RayBiotech；細胞及組織總蛋白抽提試劑盒、BCA蛋白質定量試劑盒、蛋白預染Marker、RIPA緩沖液、HRP-結合的抗生物素抗體、一級抗體(anti-GLUT4) 、Horseradish Peroxidase(HRP)結合的二級抗體：碧云天公司；顯影液、Sangon 化學發光試劑盒、X光膠片、定影液：上海冠龍照相器材有限公司；β巰基乙醇、生物素標記的蛋白分子量標準、溴酚藍、過硫酸銨等試劑：上海生工生物技術有限公司；PVDF膜：millipore公司；電泳緩沖液及丙烯酰胺：上海迪生生物技術有限公司；TrizolTM、DEPC處理水、焦碳酸二乙酯(DEPC)、逆轉錄試劑：上海基爾頓生物科技(上海)有限公司；氯仿 HPLC級 ：上海試劑一廠 ；FQ-PCR試劑盒：美國ABI公司；Trizol：GIBCO公司；異丙醇 HPLC級：蘇州振亞化工廠；SYBRGreen PCR試劑盒：廣州達暉生物公司；p65、NF-κB p65(E498) Antibody、IgG抗體：Cell Signaling公司。

1.3主要儀器分析天平shamg pingMD100-1，上海天平儀器廠；低速離心機：anke TDL-5-A 上海安亭科學儀器廠；顯微鏡：OLYMPUS BH2，奧林巴斯；石蠟切片機Leica RM2235，萊卡公司(奧地利)生產；LeicaHI1210水浴鍋，萊卡公司(奧地利)生產；LeicaHI1220水平干式烘干儀，萊卡公司(奧地利)生產；Alpha-1506P型紫外可見分光光度計，上海譜元儀器有限公司；迪瑞全自動生化分析儀，長春迪瑞醫療科技股份有限公司；芬蘭雷勃酶標儀,芬蘭雷勃；勻漿器(FLUKO 6-10)：德國FLUKO； 低溫冷凍離心機1-15K3K15：美國Sigma；電泳儀mini protean 3 cell： BIO-RAD公司；電轉儀，大連競邁科技有限公司；發光劑 ECLTM western blotting detection：GE healthcare；磁力攪拌器：太倉華美生化儀器廠 ；脫色搖床：麒麟貝爾儀器廠；WB圖像分析系統 GK-330C：美國聯合生物科技有限公司；旋渦振蕩器(Vortex) XW-80A：上海青浦瀘西儀器廠；手握式電動勻漿機FLUKO(F6-10)：德國FLUKO；干式恒溫器K10CD：杭州藍焰科技有限公司；低溫冷凍離心機1-15K 3K15、生物安全柜TYPE B2：美國Sigma；Real-time檢測儀(7300Sequence Detection System) ABI-7300：美國ABI。

1.4方法

1.4.1組別設計實驗用藥前各組大鼠先做心電圖檢查，棄去心律失常、ST段改變、T波異常的大鼠，將健康Wistar大鼠心電圖檢查合格者按隨機數字表分成空白組、模型組及SK低、中、高劑量組(灌服SK自制劑)和陽性對照組(灌服復方丹參滴丸)，每組10只。

1.4.2給藥方法每日分別灌胃。空白組、模型組給予0.9%氯化鈉注射液10 ml/kg，陽性對照組給予復方丹參滴丸405 mg/kg灌胃(相當于正常成人用量的30倍)，SK高劑量組予SK 1 600 mg/kg灌胃(質量濃度為160 mg/ml，相當于正常成人用量的40倍)，SK中劑量組予SK 800 mg/kg灌胃(質量濃度為80 mg/ml，相當于正常成人用量的20倍)，SK低劑量組予SK 400 mg/kg灌胃(質量濃度為40 mg/ml，相當于正常成人用量的10倍)，共給藥10 d。

1.4.3造模方法連續3 d腹腔注射鹽酸異丙腎上腺素5 mg/kg。第8、9天給予腹腔注射鹽酸異丙腎上腺素(5 mg/kg)，空白組給予等容量生理鹽水。第10天灌藥后30 min，各組大鼠分別以 10%烏拉坦(0.5 ml/100 g體重)麻醉，仰位固定，腹腔注射鹽酸異丙腎上腺素(5 mg/kg)，空白組給予等容量的生理鹽水。模型成功的判斷指標:空白組與模型組心電圖進行比較,觀察是否發生心肌缺血改變。判斷心肌缺血的心電圖標準:① ST段水平向下或向上偏移≥0.1 mV； ② T波高聳超過同導聯R波的1/2； ③ T波高聳伴ST段移位； ④出現異常Q波；⑤心動過速、早搏或其他心律失常；大鼠心電圖改變具備以上條件之一者即可判斷為心肌缺血陽性。陰性判斷標準：①S-T段斜形偏移，或水平偏移<0.1 mV；②T波低平或雙向倒置。以模型組大鼠心電圖ST段抬高≥ 0.1 mV作為造模成功的標志。

1.4.4觀察方法造模成功2 h后腹主動脈取血，3 000 r/min離心20 min，取血清1.5 ml，放入2 ml EP管中，存于-20℃冰箱備用，用酶聯免疫吸附試驗檢測灌胃后心肌缺血模型大鼠血清中TNF-α含量和IL-1、IL-6、VCAM-1 含量。

造模成功后2 h腹主動脈采血后處死大鼠，取心臟，用生理鹽水沖洗除去血污，剔盡脂肪組織等非心肌組織，順房室溝從心尖到心基底部平行將心室切開。(1)取心室肌組織修成大約1 mm3的小塊。投入預先配好的固定液中(10%甲醛)使組織、細胞的蛋白質變性凝固，以防止細胞死后的自溶或細菌的分解，從而保持細胞本來的形態結構。經過脫水透明、浸蠟包埋、切片與貼片、脫蠟染色、脫水透明、封固后應用顯微鏡觀察。(2)取心室肌組織，分析天平稱重，快速放入已標記好的凍存管內，置于液氮中保存備用，整個過程不超過3 min。待心室全部取完，置于-80℃冰箱保存。檢測時解凍。

1.5統計學處理應用SPSS13.0軟件進行t檢驗。

2結果

2.1顯微鏡下觀察空白組炎癥輕度，血管擴張輕度，肌纖維斷裂輕度，纖維化輕度；模型組肌纖維斷裂嚴重，炎癥細胞嚴重，纖維化嚴重，間質水腫嚴重，血管擴張嚴重，肌束排列不整齊；陽性對照組可見心肌輕度纖維化，炎癥輕度，肌纖維斷裂輕度，血管擴張輕度，間質水腫；SK低劑量組肌纖維斷裂嚴重，炎癥細胞嚴重，纖維化嚴重，間質水腫嚴重，血管擴張中度，肌束排列不整齊；SK中劑量組心肌纖維化中度，炎癥細胞浸潤嚴重，肌纖維斷裂輕度，中度間質水腫，肌束紊亂，血管擴張輕度；SK高劑量組肌束排列整齊，炎癥細胞浸潤中度，輕度纖維化，血管輕度擴張。

2.2SK對心肌缺血大鼠血清IL-1和IL-6變化的影響空白組、陽性對照組、SK低劑量組、SK中劑量組、SK高劑量組IL-1、IL-6顯著降低，其變化與模型組比較有非常顯著性差異(P<0.01)；與陽性對照組比較，SK高劑量組可使IL-1、IL-6活性減少，但無統計學意義(P>0.05)。見表1。

組別IL-1IL-6空白組66.60±19.671)68.59±19.621)模型組168.98±49.94158.90±30.61陽性對照組82.77±14.601)86.84±14.611)SK低劑量組76.89±17.681)92.47±9.691)SK中劑量組87.69±17.311)83.79±9.761)SK高劑量組70.90±16.401)82.79±12.051)

與模型組比較：1)P<0.01

2.3SK對心肌缺血大鼠血清TNF-α和VCAM-1變化的影響見表2。空白組、陽性對照組、SK低劑量組、SK中劑量組、SK高劑量組TNF-α顯著降低，其變化與模型組比較差異顯著(P<0.01)；與陽性對照組比較，SK高、中劑量組可使TNF-α活性減少，但無統計學意義(P>0.05)。空白組、陽性對照組、SK低劑量組、SK中劑量組、SK高劑量組VCAM-1顯著降低，其變化與模型組比較差異顯著(P<0.05)；但SK高、中、低劑量組作用不及陽性對照組。

2.4SK對心肌細胞中IκB蛋白表達的影響空白組、陽性對照組、SK低、中、高劑量組IκB蛋白表達顯著升高(2.917±0.220，2.795±0.775，1.673±0.365，1.741±0.161，1.836±0.169)，其變化與模型組(0.957±0.508)比較有顯著差異(P<0.05，P<0.01)。

組別TNF-α(pg/ml)VCAM-1(μg/L)空白組345.07±178.102)162.83±20.821)模型組803.08±292.14319.33±38.32陽性對照組456.02±165.082)201.53±29.221)SK低劑量組500.15±61.772)205.52±34.342)SK中劑量組422.76±35.782)243.81±31.721)SK高劑量組426.79±41.492)208.59±35.791)

2.5SK對實驗性心肌缺血大鼠心肌NF-κB活性、NF-κBp65 mRNA和蛋白表達的影響空白組、陽性對照組、SK低、中、高劑量組NF-κBp65蛋白表達降低(11 041.56±2 458.59，11 507.00±3 539.74，13 067.89±1 792.62，12 484.33±4 534.51，12 830.11±4 346.18)，其變化與模型組(16 816.00±3 389.14)比較有統計學意義(P<0.05，P<0.01)。NF-κBp65 mRNA基因表達也降低〔(0.139±0.053)%，(0.471±0.212)%，(0.453±0.081)%，(0.360±0.080)%，(0.302±0.113)%〕，其變化與模型組〔(0.732±0.188)%〕比較差異顯著(P<0.05，P<0.01)；SK高、中、低劑量組均數小于陽性對照組，但無統計學意義(P>0.05)。空白組、陽性對照組、SK低、中、高劑量組NF-κB活性表達降低(5 456.250±695.490，8 262.484±720.988，10 521.796±1 045.135，10 423.276±1 347.474，7 666.390±1 139.444)，其變化與模型組(14 181.782±1 367.063)比較有顯著性差異(P<0.05)；SK高劑量組小于陽性對照組，但無統計學意義(P>0.05)。

3討論

心肌缺血損傷時，心肌超微結構變化主要表現為細胞膜和細胞器膜完整性破壞，如線粒體腫脹、嵴斷裂、溶解和空泡形成，基質致密顆粒增多，并伴有大量的鈣沉積、肌纖維斷裂、節段性溶解和出現收縮帶等。這些超微結構的改變被認為是心肌缺血時由可逆性損傷向不可逆性損傷改變的病理標志。本研究根據蘇木素-伊紅(HE)染色結果提示，SK可減輕心肌結構損傷。

在心肌缺血的發生、發展和轉歸中，信號轉導可以調控心肌細胞的損傷。心肌缺血時存在著廣泛而復雜的信號傳導系統交匯，并對缺血心肌發揮網絡調控的作用，因此多種細胞信號轉導系統的交匯和相互作用在疾病的發生、發展、轉歸中發揮著非常重要的作用。NF-κB能與位于多種細胞基因上的啟動子和增強子序列片段特異性位點發生特異性結合，上調多種細胞因子的轉錄活性，促進基因轉錄和表達，與機體許多炎癥、免疫性相關基因的表達關系最密切，從而參與很多與免疫、炎癥和應激有關的基因轉錄。IκBα是NF-κB的主要調控蛋白〔1～6〕。本實驗結果表明，SK可抑制NF-κBp65蛋白表達，減輕心肌缺血，抑制NF-κBp65 mRNA基因表達，抑制NF-κB活性，減輕心肌缺血。提示SK可升高心肌組織中IκB蛋白表達，從而抑制NF-κB。

在心肌缺血時，各種炎癥細胞因子往往共同發生作用，具有非常密切的相互關系。一種細胞因子可以影響另一種細胞因子對其靶細胞的作用，一種細胞因子還可以刺激其他細胞因子及炎癥介質的產生，炎癥細胞一旦釋放到血管外，會促發更多的細胞因子釋放，并誘導損傷區中性粒細胞聚集、浸潤，導致影響神經膠質細胞基因的表達，由此形成惡性循環，加重炎癥損傷。因此，炎癥標志物的變化及相互作用應當是心血管病過程中的關鍵分子，作為檢測指標對疾病的發生發展與預測預后具有重要價值，監測其濃度變化有重要意義。本研究提示SK可降低心肌缺血模型大鼠TNF-α、VCAM-1，從而起到保護缺血心肌的作用。

綜上所述，SK能有效地抗大鼠心肌缺血，其作用機制可能與SK抑制NF-κB信號轉導通路上游激酶的活化、上調IκB-α在心肌細胞質中的表達，從而阻止NF-κB核移位、降低NF-κB的活性、減少其轉錄調控的炎性因子的釋放、抑制炎癥反應有關。通過多種作用機制共同作用，起到保護心肌細胞、抗心肌缺血損傷的作用。

參考文獻4

1黃文林，朱孝峰.信號轉導〔M〕.北京:人民衛生出版社，2005:1-10.

2李鑫輝，黃政德.中醫藥對心肌缺血再灌注損傷的NF-κB信號轉導調控作用研究進展〔J〕.中西醫結合心腦血管病雜志,2007;5(2):144-5.

3Brown M,McGuinness M,Wright T,etal.Cardiac specific blockade of NF-κB in cardiac pathophysiology:differences between acute and chronic stimuli in vivo 〔J〕.Am J Physiol Heart Circ Physiol,2005;289(1):H466-H476.

4Bannes PJ.Nuclear factor-kappa B:a pivotal transcription factor in chronic inflammatory diseases〔J〕.N Engl J Med,1997;336(15):1066-74.

5Chandrasekar B,Nelson JF,Colston JT,etal.Calorie restriction attenuates inflammatory responses to myocardial ischemia-reperfusion injury〔J〕.Am J Physiol Heart Circ Physiol,2001;280(5):2094-102.

6汪永義，薛松.NF-κB與心肌缺血再灌注損傷的研究進展〔J〕.國外醫學·心血管疾病分冊，2002;29(3):140-2.

〔2015-06-24修回〕

(編輯曲莉)

通訊作者：隋殿軍(1955-)，男，教授，主要從事心血管病研究。

基金項目：國家科技重大專項資助課題(No.2009ZX09102-115)

中圖分類號〔〕R541〔

文獻標識碼〕A〔

文章編號〕1005-9202(2015)23-6655-03；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2015.23.006