培美曲塞與厄洛替尼聯(lián)合或序貫治療對(duì)肺腺癌A549細(xì)胞增殖和凋亡的影響

張小華　陳開杰　張海偉　劉　靜　賈毅敏

(重慶市腫瘤研究所藥學(xué)部,重慶　400030)

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培美曲塞與厄洛替尼聯(lián)合或序貫治療對(duì)肺腺癌A549細(xì)胞增殖和凋亡的影響

張小華陳開杰張海偉1劉靜賈毅敏

(重慶市腫瘤研究所藥學(xué)部,重慶400030)

摘要〔〕目的探討培美曲塞與厄洛替尼聯(lián)合或序貫對(duì)肺腺癌A549細(xì)胞增殖和凋亡的影響。方法以人肺腺癌 A549 細(xì)胞為研究對(duì)象，分別應(yīng)用培美曲塞與厄洛替尼單藥、聯(lián)合及不同序貫方法干預(yù)72 h后，MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖及抑制情況，并計(jì)算聯(lián)合指數(shù)(CI)，流式細(xì)胞儀(FCM)檢測(cè)細(xì)胞周期及凋亡情況，蛋白質(zhì)印跡法(Western印跡法)檢測(cè)磷酸化表皮生長(zhǎng)因子受體(p-EGFR)及磷酸化-ATK(p-AKT)的表達(dá)情況。結(jié)果培美曲塞序貫厄洛替尼組(P-E)對(duì)A549細(xì)胞增殖的抑制率及凋亡率較高，明顯高于培美曲塞(P)和厄洛替尼(E)單藥組以及厄洛替尼聯(lián)合(E+P)或序貫培美曲塞組(E-P)(P均<0.05)。E組和E+P/E-P組的G1期細(xì)胞所占比例較對(duì)照組明顯增多(P<0.05)，P組和P-E組的S期細(xì)胞所占比例較對(duì)照組明顯增多(P均<0.05)。各藥物干預(yù)組細(xì)胞凋亡率均較對(duì)照組明顯增高，且P-E組細(xì)胞凋亡率明顯高于其他組(P均<0.05)。P-E組A549細(xì)胞p-AKT及p-EGFR的表達(dá)水平均明顯低于對(duì)照組(P均<0.05)。結(jié)論培美曲塞可有效抑制肺腺癌A549細(xì)胞的增殖作用，且與厄洛替尼序貫應(yīng)用的協(xié)同效果更為明顯，其作用機(jī)制可能與p-EGFR及p-AKT信號(hào)通路相關(guān)。

關(guān)鍵詞〔〕肺腺癌；培美曲塞；厄洛替尼；序貫；聯(lián)合

1重慶市腫瘤研究所腫瘤實(shí)驗(yàn)室

第一作者：張小華(1966-)，女，副主任藥師，主要從事臨床藥理學(xué)方面的研究。

肺癌具有起病隱匿的特點(diǎn)，絕大多數(shù)患者臨床確診時(shí)已經(jīng)處于晚期，失去最佳治療時(shí)期〔1〕。化療和表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)已經(jīng)成為治療肺癌的主要方法，培美曲塞是一種新的化療藥物，屬于第3代化療藥物，可以抑制胸腺酸合成酶、甘氨酰胺核苷酸轉(zhuǎn)甲酰酶以及二氫葉酸還原酶來(lái)拮抗葉酸的代謝，進(jìn)而使核苷酸合成受到抑制，最終起到抑制腫瘤生長(zhǎng)的作用。厄洛替尼能抑制酪氨酸激酶，阻斷信息的轉(zhuǎn)導(dǎo)起到抑制腫瘤的作用〔2〕。培美曲塞與厄洛替尼聯(lián)合或序貫在臨床上被廣泛應(yīng)用于治療肺癌，并取得較好的臨床療效。本研究旨在分析培美曲塞與厄洛替尼聯(lián)合或序貫治療對(duì)肺腺癌細(xì)胞株A549細(xì)胞增殖和凋亡的影響。

1材料與方法

1.1細(xì)胞野生型K-ras基因及EGFR基因突變的肺腺癌A549細(xì)胞株均來(lái)自我院，應(yīng)用RPMI1640培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)，應(yīng)用胰蛋白酶進(jìn)行消化傳代，取對(duì)數(shù)增長(zhǎng)期的細(xì)胞應(yīng)用于實(shí)驗(yàn)。

1.2實(shí)驗(yàn)試劑及藥品RPMI1640培養(yǎng)液與胎牛血清均由美國(guó)Hyclone公司提供；青霉素、鏈霉素均由山東齊魯制藥有限公司提供；厄洛替尼由美國(guó)羅氏制藥有限公司提供，以二甲基亞砜(DMSO)溶解，應(yīng)用培養(yǎng)液將其稀釋到所用濃度；培美曲塞由齊魯制藥有限公司提供，以生理鹽水溶解，應(yīng)用培養(yǎng)液將其稀釋到所用的濃度；MTT以及DMSO均由美國(guó)Sigma公司提供；Hoechst 33258染色劑、細(xì)胞凋亡以及細(xì)胞周期檢測(cè)試劑均由上海生物技術(shù)有限公司提供。

1.3方法

1.3.1分組所有細(xì)胞平均分為培美曲塞單藥組(P)、厄洛替尼單藥組(E)、厄洛替尼聯(lián)合培美曲塞組(E+P)、厄洛替尼序貫培美曲塞組(E-P)、培美曲塞序貫厄洛替尼組(P-E)以及非藥物干預(yù)的對(duì)照組。

1.3.2指標(biāo)檢測(cè)①應(yīng)用MTT法檢測(cè)培美曲塞與厄洛替尼對(duì)A549細(xì)胞增殖的影響。將對(duì)數(shù)增長(zhǎng)期的細(xì)胞接種于96孔板上，待細(xì)胞貼壁開始生長(zhǎng)以后將不同濃度的培美曲塞和厄洛替尼加入到孔中，每個(gè)濃度均設(shè)置6個(gè)重復(fù)的孔，將僅僅含有培養(yǎng)液、細(xì)胞以及相應(yīng)濃度的DMSO孔設(shè)置為對(duì)照組，培養(yǎng)細(xì)胞72 h以后將MTT液加入到孔中，培養(yǎng)細(xì)胞4 h以后將上清液丟棄掉，加入DMSO震蕩以后應(yīng)用自動(dòng)酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀檢測(cè)570 nm波長(zhǎng)的各個(gè)孔吸光度(D)，并且計(jì)算細(xì)胞增殖抑制情況。聯(lián)合指數(shù)(CI)測(cè)定：應(yīng)用Compusyn軟件計(jì)算CI值，CI值>1表示厄洛替尼和培美曲塞有拮抗作用，CI=1表示厄洛替尼和培美曲塞具有相加作用，CI值<1表示厄洛替尼和培美曲塞具有協(xié)同作用。倒置相差顯微鏡下觀察A549細(xì)胞被厄洛替尼和培美曲塞作用以后的形態(tài)。②流式細(xì)胞儀(FCM)檢測(cè)厄洛替尼和培美曲塞作用以后細(xì)胞的凋亡情況及細(xì)胞周期分布水平。③蛋白質(zhì)印跡(Western印跡)法檢測(cè)厄洛替尼和培美曲塞作用以后A549細(xì)胞磷酸化EGFR(p-EGFR)及磷酸化-ATK(p-AKT)的表達(dá)情況。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法應(yīng)用SPSS17.0軟件進(jìn)行F檢驗(yàn)、SNK法檢驗(yàn)。

2結(jié)果

2.1各組肺腺癌A549細(xì)胞MTT檢測(cè)結(jié)果比較各藥物干預(yù)組細(xì)胞增殖抑制率均明顯高于對(duì)照組〔(3.42±0.34)%〕(P>0.05)，P組〔(48.73±3.92)%〕與E+P組〔(54.34±6.39)%〕細(xì)胞增殖抑制率比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；P-E組〔(66.53±6.42)%〕細(xì)胞增殖抑制率明顯高于P組、E+P組及E-P組〔(23.84±5.27)%〕，各干預(yù)組中E-P組細(xì)胞增殖抑制率最低，E組為(38.58±4.32)%(P均<0.05)。各干預(yù)組中CI值比較，P-E組CI值最低，為(0.37±0.03)；而E-P最高，為(1.97±0.21)；對(duì)照組為2.07±0.09，P組為1.07±0.06，E組為1.24±0.04，E+P組為1.15±0.06。

2.2各組肺腺癌A549細(xì)胞分布比例及凋亡情況比較E組、E+P組及E-P組的G1期細(xì)胞比例較對(duì)照組增高，且P組和P-E組的S期細(xì)胞比例較對(duì)照組增多(P<0.05)；G2期細(xì)胞所占比例在各藥物干預(yù)組均較對(duì)照組明顯減少(P<0.05)；各藥物干預(yù)組細(xì)胞凋亡率均較對(duì)照組明顯增高(P<0.05)。P組、E+P組與E-P組細(xì)胞凋亡率比較差異顯著(P<0.05)，而P-E組細(xì)胞凋亡率明顯高于其他組(P<0.05)。見表1。

組別細(xì)胞周期G1SG2凋亡率對(duì)照組53.1±5.235.0±4.514.0±2.90.9±0.1P組38.5±4.155.7±3.11)3.7±0.51)27.9±2.31)2)3)E組76.9±8.91)17.8±2.04.9±0.71)8.0±1.11)2)3)E+P組63.9±3.21)33.5±1.73.3±0.51)30.8±1.51)2)3)P-E組39.0±2.958.7±5.41)1.2±0.11)43.1±3.41)E-P組80.2±9.81)19.2±1.90.7±0.11)19.8±2.31)2)

與對(duì)照組比較：1)P<0.05；與P-E組比較：2)P<0.05；與E-P組比較：3)P<0.05

2.3各組A549 細(xì)胞中p-AKT和 p-EGFR 的表達(dá)比較E組(0.25±0.05)及P-E組(0.17±0.04)A549 細(xì)胞中p-AKT的表達(dá)水平較對(duì)照組(0.62±0.08)明顯下降，且P-E組明顯低于E組，而P組(1.01±0.09)較對(duì)照組明顯上調(diào)，E+P組(0.70±0.06)和E-P組(0.53±0.06)p-AKT 表達(dá)水平較E組及P-E組明顯上升(P均<0.05)。另外，P組及E-P組細(xì)胞p-EGFR的表達(dá)水平(1.67±0.07，1.70±0.06)較對(duì)照組(1.19±0.05)明顯上調(diào)，而P-E組(0.78±0.05)較對(duì)照組明顯下調(diào)，且E-P組細(xì)胞p-EGFR的表達(dá)水平較E組(1.16±0.04)及E+P組(1.05±0.06)明顯上調(diào)，而P-E組較E組及E+P組明顯下調(diào)(均P<0.05)。

3討論

研究發(fā)現(xiàn)〔3〕，K-ras的突變與惡性腫瘤的發(fā)生以及發(fā)展具有較大關(guān)系，該基因?qū)儆趓as家族中的成員，在非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)患者中，大約有20%～30%的患者存在K-ras基因突變，其中肺腺癌占大多數(shù)。且研究證實(shí)〔4〕，K-ras是引起NSCLC對(duì)EGFR酪氨酸激酶抑制劑(EGFR-TKIs)產(chǎn)生耐藥的重要因素。厄洛替尼是一種口服的EGFR-TKIs藥物，在臨床中已廣泛應(yīng)用于EGFR基因突變的肺癌患者，但不能使K-ras基因突變的肺癌患者從中獲益〔5〕。培美曲塞是新一代多靶點(diǎn)細(xì)胞毒藥物，可通過(guò)有效抑制胸苷酸合成酶、二氫葉酸還原酶等的活性對(duì)葉酸代謝起到干擾作用，從而降低DNA、RNA等的合成，起到阻斷腫瘤細(xì)胞增殖的作用。但有研究顯示，培美曲塞不能顯著改善肺癌患者的治療有效率，其與其他化療藥物的聯(lián)合應(yīng)用療效不一〔6〕。本研究提示培美曲塞及厄洛替尼對(duì)肺腺癌A549細(xì)胞的增殖均有較好的抑制作用，且培美曲塞序貫厄洛替尼對(duì)A549細(xì)胞的增殖抑制作用具有協(xié)同效果，但是厄洛替尼序貫培美曲塞對(duì)A549細(xì)胞增殖的抑制作用具有拮抗效果。分析本研究結(jié)果原因，抗腫瘤藥物的各種作用機(jī)制存在一定差異，培美曲塞與厄洛替尼抑制肺腺癌細(xì)胞的作用周期也存在差異，厄洛替尼主要應(yīng)用于細(xì)胞分裂的G1期，培美曲塞則會(huì)作用在S期，當(dāng)厄洛替尼序貫培美曲塞的時(shí)候，會(huì)使肺腺癌細(xì)胞被阻滯在G1期，致使S期的細(xì)胞顯著減少，進(jìn)而使兩者的效果具有拮抗作用，使對(duì)細(xì)胞的抑制作用降低〔7〕。厄洛替尼聯(lián)合培美曲塞的時(shí)候，G1期的肺腺癌細(xì)胞會(huì)顯著增多，但是處于S期的細(xì)胞不會(huì)明顯減少，進(jìn)而說(shuō)明培美曲塞的作用沒(méi)受到抑制作用，說(shuō)明兩種藥物聯(lián)合對(duì)細(xì)胞增殖和凋亡抑制作用沒(méi)有顯著增加的原因?yàn)閷?duì)細(xì)胞周期作用不同。而應(yīng)用培美曲塞序貫厄洛替尼能使G1期的細(xì)胞數(shù)量顯著減少，S期細(xì)胞的數(shù)目顯著增加，會(huì)使肺腺癌細(xì)胞被阻滯于S期后迅速誘導(dǎo)其進(jìn)入凋亡階段，進(jìn)而使兩種藥物作用產(chǎn)生協(xié)同效果〔8〕。FCM 法檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡率的結(jié)果與其他研究〔9〕結(jié)果具有一致性，充分證實(shí)培美曲塞序貫厄洛替尼對(duì)肺腺癌A549細(xì)胞具有較強(qiáng)的抑制作用。且研究還發(fā)現(xiàn)，培美曲塞序貫厄洛替尼對(duì)肺腺癌A549細(xì)胞具有抑制作用與p-AKT的激活有關(guān)，該物質(zhì)被激活能有效增強(qiáng)細(xì)胞對(duì)厄洛替尼的敏感性〔10〕。

綜上所述，應(yīng)用培美曲塞序貫厄洛替尼能有效抑制肺腺癌A549細(xì)胞的增殖和凋亡，有效提高肺腺癌患者的治療效果，值得臨床推廣。

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〔2014-11-10修回〕

(編輯袁左鳴/滕欣航)

通訊作者：陳開杰(1977-)，男，副主任藥師，主要從事臨床藥學(xué)方面的研究。

基金項(xiàng)目：重慶市醫(yī)學(xué)科研計(jì)劃項(xiàng)目(No.2013-2-129)

中圖分類號(hào)〔〕R73〔

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼〕A〔

文章編號(hào)〕1005-9202(2015)23-6658-02；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2015.23.007