腦梗死大鼠腦組織載脂蛋白A1、B、腦源性神經營養因子的表達和神經功能的變化

李曉斌　王曉雪　徐宏俠　劉欣欣

(開封市中心醫院神經內科，河南　開封　475003)

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腦梗死大鼠腦組織載脂蛋白A1、B、腦源性神經營養因子的表達和神經功能的變化

李曉斌王曉雪1徐宏俠1劉欣欣1

(開封市中心醫院神經內科，河南開封475003)

摘要〔〕目的探究腦梗死大鼠腦組織載脂蛋白(Apo)A1、ApoB、腦源性神經營養因子(BDNF)的表達和神經功能變化。方法SPF級SD雄性大鼠50只，隨機分為對照組、腦梗死1 d組、腦梗死3 d組、腦梗死1 w組和腦梗死2 w組。線栓法(MCAO)建立腦梗死動物模型。mNSS評分表評價各組大鼠神經功能變化，取大鼠腦組織進行HE染色觀察大鼠腦梗死后大腦組織損傷情況和計算梗死面積，免疫組化半定量法檢測大鼠大腦組織ApoA1、ApoB和BDNF的表達情況。結果腦梗死大鼠存活率降低；大鼠神經功能mNSS評分隨著梗死時間延長顯著降低(P<0.05)；HE染色顯示隨著梗死時間延長大鼠大腦細胞排列混亂、細胞核輪廓模糊、小膠質細胞數量明顯增多，腦梗死面積也越來越大；大鼠大腦組織ApoA1、ApoB和BDNF免疫組化顯示，ApoA1的表達隨著腦梗死時間延長顯著降低(P<0.05)，ApoB的表達隨著腦梗死時間延長顯著升高(P<0.05)，BDNF的表達在腦梗死1 d后顯著升高(P<0.05)，然后隨時間延長而下降(P<0.05)。結論腦梗死1 d后BDNF表達顯著增加是大腦一種自我代償機制，腦梗死后ApoA1表達減少、ApoB表達增加、BDNF表達減少很可能是導致腦梗死后大腦組織損傷加重和梗死面積增加的原因之一。

關鍵詞〔〕腦梗死;載脂蛋白A1;載脂蛋白B;腦源性神經營養因子;神經功能

1河南大學第一附屬醫院神經內科

第一作者：李曉斌(1972-)，男，主治醫師，主要從事腦血管病研究。

腦梗死是臨床常見的一種因供血不足而引起的大腦組織缺血性壞死的腦血管疾病〔1〕。高發于中老年群體，尤其是伴隨高血脂動脈硬化患者、高血壓患者等〔2〕。研究發現隨著我國人口老齡化趨勢嚴峻，腦梗死的發病率有逐年上升趨勢〔3〕。腦梗死因其具有很高的致死率和致殘率，嚴重影響患者預后的生活質量。研究發現血脂代謝異常是腦梗死發病的高危險因素〔4,5〕。載脂蛋白(Apo)A1和ApoB分別是高密度脂蛋白(HDL)和低密度脂蛋白(LDL)的主要結構蛋白，其表達水平將反映機體血脂代謝情況〔6,7〕；腦源性神經營養因子(BDNF)是一種內源性神經生長因子，其對神經系統損傷具有修復和保護作用〔8〕。本文探討腦梗死后大鼠腦組織載脂蛋白、BDNF的表達和神經功能的變化。

1材料和方法

1.1主要試劑及儀器蘇木素和曙紅Y試劑購自國藥集團化學試劑有限公司。大鼠ApoA1、ApoB和BDNF一抗購自Sigma-Aldrich公司，大鼠ApoA1、ApoB和BDNF二抗購自Abcam公司。SP免疫組織化學染色試劑盒購自武漢博士德生物工程有限公司，DAB顯色劑購自武漢博士德生物工程有限公司。

1.2實驗動物及分組取體重在240～260 g之間的SPF級SD雄性大鼠50只，由北京大學實驗動物中心提供，晝夜節律1 d。隨機取大鼠10只作為對照組，其余40只大鼠禁食不禁水12 h后給予乙醚麻醉，然后線栓法制作大鼠腦梗死(MCAO)動物模型。大鼠仰臥固定，充分暴露頸部皮膚，常規消毒后，打開頸部皮膚分離頸總動脈、頸內動脈和頸外動脈，結扎頸外動脈遠心端，再在頸總動脈近心端和頸內動脈遠心端放置動脈夾阻斷血流。在頸外動脈結扎出剪斷并插入栓線直至頸內動脈處，打開頸內動脈夾，繼續推進栓線至遇阻力，阻斷大腦中動脈血流后將栓線深插入18～20 mm，固定栓線縫合皮膚。2 h后再次乙醚麻醉，拔出栓線，縫合傷口，常規消毒。造模后給予大鼠常規抗感染護理、自由攝食和水。將MCAO大鼠隨機分為腦梗死1 d組(大鼠造模后1 d，10只)、腦梗死3 d組(大鼠造模后3 d，10只)、腦梗死1 w組(大鼠造模后1 w，10只)和腦梗死2 w組(大鼠造模后2 w，10只)。

1.3腦梗死大鼠神經功能mNSS評分參照文獻方法，對對照組大鼠、MCAO大鼠造模后1 d、3 d、1 w和2 w進行運動、感覺、平衡木和反射活動四個方面的神經功能mNSS評分，評分滿分為18分。

1.4腦梗死大鼠腦組織的HE染色分別在造模后1 d、3 d、1 w和2 w取對應組的MCAO模型大鼠乙醚麻醉后，固定于手術臺上，心臟灌注生理鹽水沖洗后灌注4%多聚甲醛固定，斷頭取腦，標本進行石蠟包埋后，經切片、甲醇固定、染色等步驟制備得HE染色切片，于顯微鏡下觀察大鼠腦梗死后腦組織損傷情況與梗死面積。對照組大鼠用同等方法得到大腦組織石蠟塊樣品。每只大鼠隨機選取5個視野計算腦梗死面積比，腦梗死面積比=視野下腦梗死面積/視野大腦組織總面積×100%。

1.5免疫組化法檢測腦梗死大鼠大腦組織中ApoA1、ApoB和BDNF的表達取對照組大鼠大腦石蠟塊和MCAO模型組大鼠石蠟塊，經過修整后，于切片機上切得4 μm病理切片。實驗中采用SP法，以PBS緩沖溶液作為一抗的陰性對照，進行ApoA1、ApoB和BDNF的免疫組化，實驗操作按照SP試劑盒進行。用染色強度與出現陽性反應面積的百分率之間的乘積作為免疫組化半定量結果。隨機選擇5個視野進行鏡檢統計，具體如下：染色無色計為0分，淺黃色計為1分，棕黃色計為2分，深棕色計為3分；出現陽性反應面積的百分率在10%以下計為1分，在10%～50%之間計為2分，在50%～75%之間計為3分，在75%以上計為4分；半定量結果以大于2計為陽性，否則陰性。

1.6統計學方法采用SPSS17.0軟件進行t及χ2檢驗。

2結果

2.1大鼠MCAO腦梗死動物模型的建立大鼠MCAO腦梗死模型建立后，大鼠多表現為右前爪不能伸展或存在右側轉圈障礙。腦梗死1 d組大鼠存活10只、腦梗死3 d組大鼠存活8只，腦梗死1 w組大鼠存活7只，腦梗死2 w組大鼠存活7只，對照組大鼠存活10只。

2.2腦梗死大鼠神經功能mNSS評分與對照組大鼠mNSS評分(1.07分)比較，造模后各組大鼠mNSS評分均顯著升高(P<0.05)；與腦梗死1 d組大鼠mNSS評分(13.84分)比較，腦梗死3 d組(9.77分)、腦梗死1 w組(7.02分)和腦梗死2 w組(4.93分)mNSS評分均明顯降低(P<0.05)，且腦梗死大鼠有明顯隨著時間延長mNSS評分降低趨勢。

2.3腦梗死大鼠腦組織HE染色與對照組大鼠大腦HE染色切片比較，腦梗死1 d后大鼠大腦組織變化最小，幾無明顯變化；腦梗死3 d后大鼠腦組織出現水腫，細胞排列較為紊亂，且星形膠質細胞分布較為分散；腦梗死后1 w后大腦細胞排列更為紊亂且細胞核仁較為模糊，出現大量小膠質細胞和噬神經細胞現象；腦梗死2 w后大鼠大腦細胞結構模糊，小膠質細胞數量顯著性增多。見圖1。大鼠腦梗死面積比有明顯的隨著梗死時間延長而增大的趨勢。對照組0.55%，腦梗死1 d，3 d,1 w,2 w組分別為11.23%、14.09%、16.97%、25.88%。

2.4大鼠大腦組織ApoA1、ApoB和BDNF的表達鏡檢結果發現，ApoA1在對照組表達最多，在腦梗死2 w組表達最少，ApoA1明顯表現出隨腦梗死時間延長而減少趨勢；ApoB在對照組表達最少，而在腦梗死2 w組表達最多，ApoB明顯表現出隨腦梗死時間延長而增大趨勢；BNDF在對照組和腦梗死2 w組表達最少，在腦梗死1 d組表達最多，見表1。

蛋白ApoA1ApoBBDNF對照組9.30±1.491.40±0.841.10±0.74腦梗死1d組5.60±1.581)4.90±1.201)9.70±1.641)腦梗死3d組4.50±1.311)6.38±1.851)2)8.13±1.891)腦梗死1w組3.29±1.601)7.14±1.861)2)6.43±1.991)2)腦梗死2w組1.86±0.901)2)9.71±1.601)2)3)1.14±0.693)4)

與對照組比較:1)P<0.05；與腦梗死1 d組比較:2)P<0.05；與腦梗死3 d組比較:3)P<0.05；為與腦梗死1 w組比較:4)P<0.05

圖1　腦梗死大鼠腦組織的HE染色結果(×200)

3討論

腦梗死是臨床上常見且高發的腦血管疾病，因高復發率、高死亡率和高致殘率嚴重影響患者預后生活并加重患者家庭負擔。近年來的臨床數據顯示，腦梗死的發病率在我國有明顯上升趨勢，因此對腦梗死的深入有助于為臨床疾病治療新靶點、新方法提供新思路。血脂代謝異常而導致血脂水平紊亂是腦梗死發病的高危險因素，大量臨床研究證實了動脈粥樣硬化與腦梗死之間的密切聯系〔9,10〕。血脂水平升高后，一方面會引起血管壁病變誘發炎癥導致血小板凝集形成血栓阻塞腦血管造成大腦缺血性壞死，另一方面血脂黏稠會使血管狹窄誘發腦供血不足導致腦梗死。載脂蛋白是血漿蛋白的基本組成部分，對血脂正常代謝具有重要作用。ApoA1是HDL的重要結構蛋白，研究發現ApoA1有促進脂類運輸、調節脂類代謝酶活性和促進膽固醇分解等重要生物活性，其對維持血脂代謝正常和降低動脈粥樣硬化病變具有重要意義〔11〕；而ApoB是LDL的主要結構蛋白，它可以誘導膽固醇在巨噬細胞中發生內酯化反應，誘導巨噬細胞轉變為泡沫細胞，加劇動脈硬化病變發展〔12〕。BDNF是一種重要的神經生長因子，具有促進血管和神經生成、促進感覺器官恢復和提高運動能力的生物作用〔13〕。研究發現BDNF可以減少神經元細胞氧化損傷，抑制細胞氨基酸興奮中毒，促進神經干細胞的生長與分化〔14,15〕。本研究表明無干涉腦梗死后大腦損傷逐步加重且腦梗死面積逐漸增大。大鼠腦梗死后部分腦組織會因缺血壞死而喪失其功能，而且損傷大腦細胞會釋放出大量谷氨酸鹽，導致毗鄰細胞氨基酸興奮性中毒，大量的外Ca2+會內流進細胞誘導損傷細胞大量凋亡。大腦水腫和損傷會影響組織內脂質正常代謝，加劇腦梗死發展。本研究分析發現大鼠腦梗死后大腦組織ApoA1隨著梗死時間呈下降趨勢，ApoB隨著梗死時間呈上升趨勢，而BDNF在梗死后表達迅速升高然后隨時間呈下降趨勢。BDNF在腦梗死后迅速升高可能是大腦組織應急期的自我代償機制，對大腦進行保護和修復，但是隨著梗死時間延長大量神經細胞凋亡最終導致BDNF水平降低。

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〔2014-05-17修回〕

(編輯安冉冉/曹夢園)

中圖分類號〔〕R743〔

文獻標識碼〕A〔

文章編號〕1005-9202(2015)23-6675-03；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2015.23.014