雷公藤多苷納米乳在大鼠腎移植中的免疫抑制作用

王遠濤　王　鋼　張　坤　劉　念　王永生　王偉剛　周洪瀾　傅耀文

(吉林大學白求恩第一醫院泌尿外二科，吉林　長春　130021)

?

雷公藤多苷納米乳在大鼠腎移植中的免疫抑制作用

王遠濤王鋼張坤劉念王永生1王偉剛周洪瀾傅耀文

(吉林大學白求恩第一醫院泌尿外二科，吉林長春130021)

摘要〔〕目的制作雷公藤提取物新劑型，提高生物利用度，嘗試開發有品質的免疫抑制劑。方法利用自制雷公藤多苷納米乳(Nano-TII)，腹腔內或口服給藥途徑作用于實驗用大鼠腎移植模型。Wistar大鼠為供體，SD大鼠為受體行大鼠原位腎移植術。空白對照組：給予口服安慰劑；對照組：給予口服環孢素(CsA)；實驗對照組：給予常規的雷公藤提取物片劑(TII)；實驗組：給予新型納米雷公藤提取物膠囊；手術對照組：SD大鼠近交系原位腎移植，給予口服安慰劑。檢測腎移植術后大鼠尿量、腎功、肝功、急性排斥反應發生率、移植腎/受體存活率。結果實驗組大鼠移植腎生存期為(86±12.2)d；生存分析log-rank檢驗結果認為新型納米乳雷公藤藥物組的大鼠生存期顯著長于傳統雷公藤給藥組(P<0.01)，但與標準對照組相比沒有統計學意義(P=0.124)。藥物毒性大小排序為：TII>Nano-TII>CsA。結論在大鼠腎移植模型中，移植術后單獨應用雷公藤多苷納米乳相比傳統TII具有更好的移植物存活率和更小的藥物毒性，此項工作為納米技術雷公藤新劑型的臨床應用提供了實驗依據。

關鍵詞〔〕大鼠腎移植模型；雷公藤多苷；納米技術

1吉林大學藥學院

第一作者：王遠濤(1978-)，男，醫學博士，副主任醫師，主要從事器官移植臨床研究。

慢性移植腎腎病(CAN)是由鈣調磷酸酶抑制劑(CNI)類藥物引起的，主要病理表現為腎血管玻璃樣變；同時，此類藥物也能引起移植后高血壓、高血糖、血脂代謝紊亂和致癌基因表達〔1〕。環孢素(CsA)作為廣泛應用的CNI類傳統免疫抑制劑，其局限性主要表現為藥物相關性毒副反應和急性排斥反應〔2～5〕。目前，具有免疫抑制功能的中藥有很多，而雷公藤的功效較為明確，且已被常規用于一些自身免疫疾病(如風濕性關節炎)的治療中〔6～10〕。在器官移植領域，雷公藤的應用并不普遍。常用的雷公藤提取物片劑生物利用度低，而且血藥濃度不穩定，且易造成口腔潰瘍、蛋白尿、胃腸道潰瘍等明顯的副作用，也限制了其大規模應用。在腎移植術后早期的雷公藤提取物轉換仍存在較大風險。因此，開發新型雷公藤提取物制劑具有合理性。

1材料與方法

1.1實驗動物供體為健康6～8周齡Wistar大鼠40只，雌雄不限，體重250～300 g；受體為健康6～8周齡SD大鼠60只(20只SD-SD移植作為手術對照組)，雄性，體重300～350 g。使用實驗動物中心提供的標準鼠飼料和滅菌水，動物飼養間清潔級別為SPF級。實驗過程中對動物的處置符合相關動物倫理學的標準。

1.2實驗用藥物高效液相色譜儀測定雷公藤多苷在IPM、大豆油、藥用石蠟和橄欖油以及表面活性劑EL-40、RH-40 和Tween-80中的溶解度。根據納米乳的評價標準，利用序貫設計思想，采用滴定法繪制偽三元相圖，制備雷公藤多苷納米乳(Nano-TII)；口服CsA軟膠囊，杭州中美華東制藥有限公司；雷公藤多苷片(TII)，黃石飛云制藥有限公司。

1.3實驗分組設計將已接受腎移植的SD大鼠隨機數字表法分為5組，除手術對照組為2只外其余每組均為10只。A組(空白對照組)：給予口服安慰劑；B組(標準對照組)：給予口服CsA；C組(實驗對照組)：給予常規的TII；D組(實驗組)：給予新型Nano-TII；E組(手術對照組)：SD大鼠近交系原位腎移植，給予口服安慰劑。口服途徑為灌胃，術后3 d開始。給藥劑量分別為：B組CsA 15 mg·kg-1·d-1；C組：TII 30 mg·kg-1·d-1；D組：10%自制Nano-TII 30 mg·kg-1·d-1；A、E組：安慰劑為生理鹽水。于術后第1天開始給藥至大鼠死亡、24 h收集不到尿液或術后90 d試驗結束時處死(處死組內1只作為代表，其余大鼠繼續觀察移植物生存期)取移植腎病理。

1.4腎移植模型供、受體大鼠均用0.3%戊巴比妥按照1 ml/100 g體重腹腔注射麻醉，鉗夾雙下肢無疼痛反射時認為已深度麻醉。均采取腹正中切口入路。

器官獲取：手術取左腎，先切去左腎包括全長輸尿管、整個膀胱，近端腎動靜脈需要分別帶有腹主動脈瓣和下腔靜脈瓣。4℃高滲灌注液灌注后低溫保存。

受體移植：深度麻醉后，切除雙腎，右腎血管保留并游離遠端，采用Engelbrecht法，在手術顯微鏡下用10～0無損傷帶針縫合線，端端吻合共受體腎動脈〔11〕。靜脈吻合略加改進，先受體腎靜脈從長約1.0 cm的硬膜外管(內徑約0.15 cm)內穿出后翻轉套在硬膜外管上，供腎靜脈直接套扎在硬膜外管上即可，無須縫合。輸尿管與膀胱吻合采用一種改進的膀胱瓣片法進行〔11〕。所有受體均于移植后當天關腹前，腹腔注射氨芐青霉素50 mg/kg預防感染。

1.5血尿標本檢測各組動物移植后放入代謝籠,每周記錄1次24 h尿量、采1次外周血，采用斷尾采血法。血標本用于檢測血肌酐(Scr)、谷丙轉氨酶(ALT)、谷草轉氨酶(AST)。

1.6移植腎病理移植用于光鏡觀察的組織采用常規石蠟切片,蘇木素-伊紅(HE)、染色。應用Olympus 顯微鏡、攝像機,100倍視野下觀察、測量。病理診斷標準:①腎小管損傷標準:細胞及細胞間空泡變性、腎小管塌陷(與間質纖維化和腎小管膜增厚無關)及腎小管腫脹;②腎小管間質損傷標準:單個核細胞浸潤,間質細胞空泡變性、水腫及間質纖維化;③腎小動脈病變:腎內小動脈管壁肌性增厚或入球小動脈的玻璃樣變及損傷。

1.7統計學方法采用SPSS19.0 軟件進行t檢驗。

2結果

2.1實驗動物基本狀態實驗共納入42只成功移植的SD大鼠作為研究對象，均在手術后2 h內恢復正常行為狀態，并開始進食、排便，術后3 d內獨籠飼養，3 d后同實驗組大鼠合籠。A、E組大鼠移植物存活時間組間差異顯著。E組大鼠移植物生存期最長(<200 d)；其中A組10只大鼠存活時間最短(9±2.5)d；其余各組與A組相比均遠超出其生存期(P<0.05)，其中B組為(124±22.3)d，C組(70±62.6)d，D組(86±12.2)d。

2.2受體SD大鼠移植物功能及藥物毒性作用大鼠移植腎臟功能由24 h尿量和Scr表示，藥物毒性作用以大鼠外周血ALT和AST表示。如圖1所示，E組術后尿量(20.4±3.1)ml/24 h，B組術后尿量(18.2±2.8)ml/24 h；兩組尿量標準差較小，尿量浮動不大，大鼠尿量基本穩定。A組大鼠在1 w左右的時間相繼進入無尿期，C、D兩組尿量進行性下降，在術后7 w左右C組尿量下降趨勢明顯超越D組。移植后SD大鼠的Scr均在術后出現一次突增，大約1 w左右恢復正常；術后3～6 w基本維持平穩，第7周以后C、D兩組血肌酐開始陡增。見圖2。

各組大鼠基線肝功能屬于正常范圍(ALT與AST)。從圖3、圖4中可以看出，C組折線基本處于B組和D組上方，E組肝功能基本維持在正常范圍內。B、C、D組大鼠的轉氨酶血清濃度基本隨給藥時間增長而持續穩定增長，以B組增長趨勢更為明顯。

圖1　移植后SD大鼠尿量變化

圖2　移植后大鼠Scr變化

圖3　移植后大鼠ALT變化

圖4　移植后大鼠AST變化

圖5　移植后90 d大鼠肝臟HE染色切片(×100)

在SD大鼠接受移植術后90 d時，各組選取一只大鼠取肝臟，所有大體肝臟形態正常,色澤鮮紅,質地柔軟。做成HE染色切片，結果如圖5所示。A組與E組干細胞形態基本正常，肝索排列規則,肝小葉分界尚可,細胞結構較清晰,肝竇及匯管區均正常,未見肝細胞變性、壞死或纖維化等病理變化，核分裂象普遍。B、C、D組肝索排列輕度紊亂,肝小葉分界尚清楚,肝竇正常,肝細胞伴有少量水腫和脂肪變樣變，其中C組脂肪樣變相比最明顯，還有少許嗜酸性改變。2.3大鼠移植腎生存期術后90 d(此期間內沒有意外死亡大鼠)是本實驗經過摸索，人為規定的獲取移植腎病理的最適時間。筆者希望觀察腎功能存活時間能夠維持的確切時間，因此觀察到本文截稿之日，共221 d。如圖6所示，B、C、D生存曲線都在A組與E組的曲線范圍之間，且與A組進行log-rank檢驗均有統計學意義(P<0.05)，其中術后90 d存活比例A組為0，B組10只(100%)，C組3只(30%)，D組5只(50%)，E組2只(100%)；術后>200 d存活比例A組為0，B組3只(30%)，C組2只(20%)，D組3只(305)，E組2只(100%)。D組與B組的生存曲線相比，沒有統計學差異。而D組的Kaplan-Meier曲線與C組相比，有顯著性差異。在5組大鼠的生存曲線中，可大致觀察到D組生存曲線處于B組及C組之間。

圖6　SD大鼠移植生存曲線

2.4移植腎病理檢查各組大鼠移植腎獲取時大體標本所見：腎臟體積不同程度小于E組，色澤從紅潤到蒼白不一。各組移植腎臟HE切片提示了不同程度的單核細胞浸潤、分裂核細胞浸潤、腎小球硬化、玻璃樣變、腎小管萎縮、間質纖維化和小動脈內膜纖維性增厚等急、慢性排異反應組織病理學改變。

3討論

雷公藤多苷提取物在動物器官移植模型以及臨床器官移植領域均有應用，效果不一而終。雷公藤提取物的免疫抑制作用機制并不十分清楚，有研究表明它能抑制由抗原和細胞因子(白介素-2、-4、-15)激發的T淋巴細胞的活化和增殖，抑制輔助性CD4+T細胞功能，改善CD8+T 細胞功能，下調CD4/CD8的比例，還可以抑制B細胞增殖及產生免疫球蛋白。更重要的是在細胞實驗研究中發現，雷公藤提取物與FK結合蛋白(FKBP)-12結合，生成的免疫復合物具有免疫抑制作用。此復合物對鈣調磷酸酶的活性無影響，但可與哺乳動物的雷公藤提取物靶分子(mTOR)結合，并抑制其活性。此種抑制阻礙了細胞因子驅動的T細胞增殖，即抑制細胞周期中G1期向S期的發展，從根本上與CNI類發揮免疫抑制作用的靶點不同。相對CNI類藥物來說，因其具有低/無腎毒性的特點而得到移植醫生的青睞。然而對于維持移植腎術后器官免疫狀態的效果，目前僅見于少量的臨床報道，缺乏可靠的動物實驗研究以及臨床研究，尚未有明確的結論。

由于表示移植術后免疫維持狀態的指標有很多，個體及組內、組間差異也不可避免會影響這些檢驗指標的準確性和真實性。因此筆者希望從大鼠腎移植模型體內異體腎臟的存活時間來粗略地描述所用藥物的免疫維持效果。所以主要的觀察指標是大鼠移植腎存活狀況。本研究結果說明自制Nano-Ⅱ具有免疫抑制作用，能夠在單獨給藥的情況下維持一段時間的移植物功能狀態。統計學上不能認為Nano-TII和CsA單獨給藥時兩組大鼠移植腎的生存期來自不同總體。這表示兩者單獨用藥，在該實驗條件下發揮作用相似。而Nano-TII和Nano-TII相比，自制Nna-Ⅱ在移植大鼠移植物排異反應的免疫抑制作用強于傳統片劑。

關于藥物對于移植腎功能狀態的影響方面，筆者分析了尿量和Scr。Scr水平反映腎功能狀態比尿量更敏感。術后Scr的突增可以由手術過程中移植物的冷、熱缺血時間所以及受體切除雙側腎臟至移植腎開放灌注的手術時間所解釋。在此期間，受體因無腎期體內的代謝累積使內生性肌酐積蓄，而異體腎臟的離體時間則會引起細胞水腫延緩腎臟功能恢復。

然而腎臟病理切片反應排斥反應情況并不統一。原因可能是3個月內大鼠個體可能發生多次急性排斥反應，也有可能即產生慢性排斥反應。而獲取病理的時間只有1次，在獲取的時間點，每只大鼠都有可能處在急性或慢性排異反應的不同階段。可見提示需要進一步采取免疫組化染色，以及根據大鼠一般狀況表現、尿量及Scr的變化獲取即時病理來了解移植腎組織學改變。

本實驗是以動物模型為基礎的藥效及藥物毒性試驗的初步探索，在實驗設計和實驗方法有其缺陷，也并沒有針對作用機制進行相應探索。但是，在此類研究并不廣泛的前提下，筆者的工作為納米技術雷公藤新劑型的臨床應用提供了實驗依據。在器官移植領域的臨床問題中，預想通過轉換應用新型免疫抑制劑來維持器官功能并減少傳統CNI類藥物因引起的遠期移植物功能衰竭的征途還很遙遠。但是移植術后單獨應用Nano-TII可獲得相比傳統TII更好的移植物存活率和更小的藥物毒性。

參考文獻4

1Nankive BJ.The natural history of chronic allograft nephropathy〔J〕.N Eng J Med,2003;349(24):2326-33.

2Keown PA,Ulan RA,Wall WJ,etal.Immunological and pharmacological monitoring in the clinical use of cyclosporin A〔J〕.Lancet,1981;1:686.

3Irschik E,Tilg H,Niederwieser D,etal.Cyclosporin blood levels do correlate with clinical complications〔J〕.Lancet,1984;2(8404):692-3.

4Kahan BD,Wideman CA,Reid M,etal.The value of serial serum trough cyclosporine levels in human renal transplantation〔J〕.Transplant Proc,1984;16:1195.

5Klintmalm G,Sawe J,Ringden O,etal.Cyclosporine plasma levels in renal transplant patients:association with renal toxicity and allograft rejection〔J〕.Transplantation,1985;39:132.

6McDonald SP.ESRD in Australia and New Zealand at the end of the millennium:a report from the ANZDATA registry〔J〕.Am J Kidney Dis,2002;40(6):1122-31.

7Qin WZ,Liu CH,Yang SM.Tripterygium wilfordii Hook F in systemic lupus erythematosus〔J〕.Chin Med J,1981;94:827.

8Guan F,Wang DH.Observation of therapeutic effect of Tripterygium wilfordii in psoriasis〔J〕.J Clin Dermat,1981;10:91.

9Yu D.Clinical observation of 144 cases of rheumatoid arthritis treated with glycosides of Tripterygium wilfordii〔J〕.J Trad Clin Med,1983;3:125.

10Engelbrecht G,Kahn D,Duminy F,etal.New rapid technique for renal transplantation in the rat〔J〕.Microsurgery,1992;13:340-4.

11Pietsch A,Nett PC,Sollinger HW,etal.Modified technique of ureteroureterostomy in rat kidney transplantation〔J〕.Microsurgery,2004;24:345-9.

〔2015-09-15修回〕

(編輯曲莉)

通訊作者：傅耀文(1957-)，男，醫學博士，教授，主任醫師，主要從事器官移植臨床研究。

基金項目：國家自然科學基金面上項目(81470975)；吉林省科技廳項目(20120934)；吉林省衛生廳項目(2014Z042，2013Z002)

中圖分類號〔〕R392.4〔

文獻標識碼〕A〔

文章編號〕1005-9202(2015)23-6680-04；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2015.23.016