MicroRNA-21(miR-21)在大腸癌細(xì)胞中的表達(dá)及其靶基因

熊兵紅　馬　利　程　勇　張才全

(昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院，云南　昆明　400016)

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MicroRNA-21(miR-21)在大腸癌細(xì)胞中的表達(dá)及其靶基因

熊兵紅馬利1程勇2張才全2

(昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院，云南昆明400016)

摘要〔〕目的探討微RNA(miRNA)-2l在大腸癌(CRC)細(xì)胞中的表達(dá)，抑制miRNA-21(miR-21)表達(dá)對(duì)大腸癌細(xì)胞中磷酸醋酶張力蛋白同源物(PTEN)、PI3K、蛋白激酶B(Akt)、基質(zhì)金屬蛋白酶-9(MMP-9)、mTOR表達(dá)的影響及其可能調(diào)控的靶基因。方法通過(guò)反義寡核苷酸(ASO)技術(shù)抑制大腸癌細(xì)胞株HCT116中miR-21的表達(dá)并加以驗(yàn)證。通過(guò)熒光定量PCR(FQ-PCR)技術(shù)及Western印跡法檢測(cè)HCT116細(xì)胞中PTEN 、PI3K 、Akt、MMP-9、mTOR表達(dá)的改變。利用生物信息學(xué)分析預(yù)測(cè)miRNA-21可能的靶基因，熒光素酶雙報(bào)告基因系統(tǒng)檢測(cè)PTEN活性。結(jié)果miR-21在HCT116中表達(dá)最高，在SW480中表達(dá)最低。miRNA-21在細(xì)胞株HCT116中的表達(dá)得到有效抑制，并且PTEN蛋白的表達(dá)明顯上調(diào)，PI3K 、Akt、MMP-9、mTOR表達(dá)下調(diào)。篩選并確認(rèn)了PTEN為miR-21的調(diào)控靶基因之一。結(jié)論抑制miR-21的表達(dá)可促進(jìn)HCT116細(xì)胞PTEN表達(dá)升高，PI3K、Akt、MMP-9、mTOR表達(dá)下調(diào)，PTEN可作為miR-21的靶基因參與調(diào)控過(guò)程。miRNA-21在CRC中表達(dá)失控，通過(guò)抑制PTEN表達(dá)促進(jìn)腫瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移。

關(guān)鍵詞〔〕大腸癌； miR-21； 腫瘤抑制基因；PTEN；Akt；MMP-9

1綿陽(yáng)市第三人民醫(yī)院2重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院

第一作者：熊兵紅(1979-)，男，碩士，主治醫(yī)師，主要從事胃腸道腫瘤的臨床及基礎(chǔ)研究。

在美國(guó)，大腸癌(CRC)在人群中的發(fā)病率和致死率均處于第三位〔1〕。而在我國(guó)，排在惡性腫瘤和致死因素的第四位〔2〕?，F(xiàn)在認(rèn)為，CRC的發(fā)生是一個(gè)多因素、多階段和多基因改變協(xié)同作用的過(guò)程，癌基因和抑癌基因的表達(dá)失調(diào)是CRC發(fā)生的分子基礎(chǔ)。miRNAs與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，很可能是一類潛在的癌基因或抑癌基因〔3〕。研究發(fā)現(xiàn)miR-21在人類多種腫瘤組織中表達(dá)上調(diào)，例如子宮頸癌、卵巢癌、肺癌、膽管癌、前列腺癌、乳腺癌 、腦膠質(zhì)瘤、肝癌、胰腺癌、胃癌、B細(xì)胞淋巴瘤、白血病等，并可能參與腫瘤的浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移。本研究擬通過(guò)反義寡核苷酸(ASO)技術(shù)抑制CRC細(xì)胞株HCT116中miR-21的表達(dá)，觀察其對(duì)PI3K/PTEN/AKT/mTOR信號(hào)通路中各蛋白的影響。

1材料與方法

1.1結(jié)腸癌細(xì)胞株結(jié)腸癌細(xì)胞系HCT116、SW480、HT29、Lovo、Colo32細(xì)胞由本實(shí)驗(yàn)室保存?zhèn)鞔?/p>

1.2主要試劑含10%小牛血清的RPMI-1640、DMEM培養(yǎng)基購(gòu)自Gibco公司，CCK-8試劑購(gòu)自日本Dojindo 公司，LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑購(gòu)自Invitrogen公司，miR-21抑制劑及其陰性對(duì)照品購(gòu)于美國(guó)Ambion公司，引物由上海生工生物工程公司合成?？俁NA 提取試劑盒，反轉(zhuǎn)錄試劑購(gòu)自TaKaRa 公司。MiR-21 qPCR檢測(cè)試劑盒SYBR Premix Ex TaqTM，磷酸酯酶張力蛋白同源體(PTEN)mRNA qPCR檢測(cè)試劑盒 Quantitect SYBR Green PCR kit均購(gòu)自大連Takara公司。PTEN、蛋白激酶B(p-AKT)、PI3K、基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)-9、 p-mTOR抗體購(gòu)自Cell Signaling公司，辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記二抗、兔抗人β-actin及ECL發(fā)光試劑盒均購(gòu)自Santa Cruz公司。BCA法蛋白質(zhì)定量試劑盒購(gòu)自海門碧云天公司。pGL3-contro 質(zhì)粒、熒光素酶雙報(bào)告基因檢測(cè)系統(tǒng)均購(gòu)自Promega公司。

1.3研究方法

1.3.1細(xì)胞培養(yǎng)HCT116、SW480、HT29、Lovo、Colo32用含10%小牛血清的DMEM培養(yǎng)液，細(xì)胞株均使用含10%小牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液，在37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞進(jìn)行試驗(yàn)。

1.3.2細(xì)胞轉(zhuǎn)染將HCT116細(xì)胞經(jīng)過(guò)0.25%胰蛋白酶消化傳代，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期HCT116細(xì)胞2×105個(gè)接種于6孔板，按試驗(yàn)設(shè)計(jì)分別轉(zhuǎn)染miR-21抑制組、陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組。分別用250 μl無(wú)血清RPMI-1640稀釋LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑8 μl和miR-21 inhibitor/NC/PBS12.5 μl，室溫靜置5 min，然后將轉(zhuǎn)染試劑分別與稀釋miR-21 inhibitor/NC/PBS混合，室溫下靜置20 min后，分別鋪到6孔板中的實(shí)驗(yàn)組、陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組(轉(zhuǎn)染HCT116細(xì)胞用無(wú)血清DMEM)，在37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱培養(yǎng)，供后續(xù)試驗(yàn)使用。

1.3.3實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RFQ-PCR)分別檢測(cè)miR-21、PTEN mRNA：按Trizol說(shuō)明書(shū)抽提總RNA。分別測(cè)定RNA在分光光度計(jì)280 nm、 260 nm和230 nm的吸收值，計(jì)算濃度并評(píng)估純度。按照試劑盒說(shuō)明書(shū)分別測(cè)定miR-21、PTEN mRNA。miR-21以U6snRNA為內(nèi)參照，PTEN以β-actin為內(nèi)參照。

1.3.4Western印跡蛋白印跡試驗(yàn)轉(zhuǎn)染后72 h分別進(jìn)行細(xì)胞裂解收集蛋白，行SDS-PAGE電泳分離蛋白，并轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜上，常規(guī)抗體雜交，增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光劑顯色。用Bio-Rad凝膠成像儀顯色儀行發(fā)光檢測(cè)，Quantity One 軟件顯色凝膠圖像的光密度值。以β-actin蛋白為內(nèi)參照，以PTEN條帶與β-actin條帶光密度值的比值表示。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均重復(fù)3次，求其均值與標(biāo)準(zhǔn)差。

1.3.5熒光素酶試驗(yàn)根據(jù)生物信息學(xué)軟件多種miRNA靶基因在線分析軟件，如TargetScan、miRanda、MiRbase 、Pictar等，預(yù)測(cè)miR-21可能的靶基因，并獲取含有作用位點(diǎn)的片段序列。預(yù)測(cè)設(shè)計(jì)引物，PTEN-3′-UTR-WT：上游為5′-TTGTGGCAACAGATAAGTTTGCAGTTGGCTAAGAGAGGTT-3′，下游為5′-CATTCCCCTAACCCGAATACATGCAT-TAGAATGTAGCAAA-3′；PTEN-3′-UTR-MT：上游為5′-TTGTGGCAACAGCTGAATCT GCAGTTGGCTAAGAGAGGTT-3′，下游為5′-ATGTAGCAAAACCCTTCGGAAACCTCTCTTAGCCAACTGC-3′。擴(kuò)增出包含有miR-21 保守性結(jié)合位點(diǎn)的3′-UTR-WT及3′-UTR-MT，擴(kuò)增產(chǎn)物凝膠電泳，然后行目的基因切膠回收， 再行目的基因和載體的連接， 構(gòu)建pGL3-PTEN-3′-UTR 和PTEN-3′-UTR-MT 載體，再依次行轉(zhuǎn)化感受態(tài)菌、目的基因測(cè)序、質(zhì)粒DNA 抽提，將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293T 細(xì)胞，然后行雙熒光素酶分析和統(tǒng)計(jì)分析。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件行t檢驗(yàn)及單因素方差分析。

2結(jié)果

2.1miR-21在大腸癌細(xì)胞中的表達(dá)miR-21在HCT116中表達(dá)最高(1.02±0.01)，在SW480中表達(dá)最低(0.32±0.02)，在HT29、Lovo、Colo32中表達(dá)量分別為(0.38±0.01)、(0.57±0.02)及(0.62±0.01)。

2.2PTEN蛋白在大腸癌細(xì)胞中的表達(dá)Western印跡分析表明PTEN蛋白在HCT116中表達(dá)最低，在SW480中表達(dá)最高。經(jīng)統(tǒng)計(jì)表明，miR-21和PTEN蛋白表達(dá)水平呈反比(P<0.01)。見(jiàn)圖1。

圖1　PTEN蛋白在各大腸癌細(xì)胞中的表達(dá)

2.3miR-21下調(diào)后在HCT116細(xì)胞中的表達(dá)miR-21在轉(zhuǎn)染抑制組及陰性對(duì)照組、空白對(duì)照組中的相對(duì)表達(dá)量分別為0.643±0.01、1.02±0.01、1.05±0.02。抑制組miR-21表達(dá)水平則明顯低于空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組(P<0.05)。

2.4miR-21下調(diào)后PTEN mRNA和蛋白在HCT116細(xì)胞中的表達(dá)miR-21下調(diào)后，PTEN mRNA的表達(dá)量在轉(zhuǎn)染抑制組及陰性對(duì)照組(NC)、空白對(duì)照組(MOCK)中相對(duì)表達(dá)量分別為(1.01±0.01)、(1.02±0.01)、(1.01±0.01)，三組間無(wú)明顯差異(P>0.05)。PTEN蛋白在IN、NC及MOCK組中相對(duì)表達(dá)量分別為1.03±0.01、1.02±0.01、2.02±0.01，在IN組中明顯升高(P<0.05)。

2.5下調(diào)miR-21 表達(dá)后對(duì)PTEN 及其下游蛋白表達(dá)量的影響PTEN蛋白在轉(zhuǎn)染抑制組及陰性對(duì)照組、空白對(duì)照組中的相對(duì)表達(dá)量分別為1.02±0.07、1.03±0.09 和2.01±0.12，在抑制組表達(dá)明顯升高(P<0.05)。而p-AKT(1.01±0.01 vs 0.99±0.01 vs 0.48±0.02)、PI3K(1.02±0.02 vs 0.98±0.02 vs 0.56±0.01)、MMP-9(1.02±0.02 vs 1.01±0.01 vs 0.64±0.01)、p-mTOR(0.99±0.01 vs 1.02±0.01 vs 0.55±0.02)在抑制組中表達(dá)量均下降(均P<0.05)，見(jiàn)圖2。

2.6下調(diào)miR-21后熒光素酶相對(duì)活性(PTEN活性)改變PTEN-3′-UTR-WT共轉(zhuǎn)染組，轉(zhuǎn)染miR-21inhibitor后熒光素酶相對(duì)活性(0.52±0.15 vs 1.13±0.10)明顯增加，與對(duì)照組(0.52±0.15)及PTEN-3′-UTR-MT組比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)；PTEN-3′-UTR-MT組轉(zhuǎn)染miR-21inhibitor后，熒光素酶相對(duì)活性(0.48±0.01)與對(duì)照組(0.49±0.15)比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，表明PTEN是miR-21的一個(gè)靶基因。

圖2　信號(hào)通路中各蛋白在大腸癌細(xì)胞HCT116中的表達(dá)

3討論

目前研究認(rèn)為，CRC發(fā)生、發(fā)展是多因素、多階段、多因子的復(fù)雜過(guò)程，在此過(guò)程中癌基因的激活與抑癌基因的丟失或表達(dá)失調(diào)是其重要特征。 miRNA是近年發(fā)現(xiàn)的一類內(nèi)源性非編碼單鏈RNA，miRNAs與腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)，有人提出了“癌miRNAs與抑癌miRNAs”的觀點(diǎn)〔3，4〕，即miRNAs在腫瘤的發(fā)生與發(fā)展過(guò)程中既可扮演癌基因也可扮演抑癌基因的角色。miR-21是miRNA中具有代表性的基因，miR-21是一種癌基因，它在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中扮演著非常重要的角色，在不同腫瘤中表達(dá)明顯上升，與腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖、侵襲轉(zhuǎn)移等生物學(xué)行為密切相關(guān)。它的編碼基因定位于17q23.2，即液泡膜蛋白基因(VMP1)編碼區(qū)，VMP1基因的第十內(nèi)含子。PTEN是一個(gè)抑癌基因，在細(xì)胞的生長(zhǎng)發(fā)育、凋亡、遷移、信號(hào)傳遞等方面起著重要的調(diào)控作用，而且在腫瘤發(fā)生發(fā)展及轉(zhuǎn)移中均起抑制作用〔5〕。PI3K/ PTEN/AKT/ mTOR信號(hào)傳導(dǎo)通路在調(diào)節(jié)細(xì)胞的凋亡、增生、分化等活動(dòng)中起著重要的作用，與惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展關(guān)系密切。PTEN作為一種具有雙重磷酸酶活性的蛋白，可依賴其蛋白磷酸酶活性去磷酸化，也可依賴其脂質(zhì)磷酸酶活性使磷酸肌醇三磷酸的D3位脫磷酸，從而阻斷AKT的作用，阻止細(xì)胞進(jìn)行分裂，并導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。PTEN的突變將使PI3K增加，AKT活性增強(qiáng)。Akt又稱為蛋白激酶B(PKB)，PTEN通過(guò)控制活化的磷脂酰3，4，5-三磷酸肌醇(PIP3)來(lái)調(diào)控 Akt的活性。因此，PTEN的突變使其喪失了調(diào)節(jié)Akt的能力，使細(xì)胞增殖失去控制，從而引起癌變。PTEN功能的下調(diào)會(huì)引起PI3K 信號(hào)通道下游包括Akt等元件的激活，從而介導(dǎo)腫瘤的進(jìn)展和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移〔6〕。PI3K/AKT/PTEN/ mTOR信號(hào)傳導(dǎo)通路活化可以抑制多種刺激誘發(fā)的細(xì)胞凋亡，促進(jìn)細(xì)胞周期進(jìn)展，從而促進(jìn)細(xì)胞的生存和增殖，同時(shí)參與血管形成，在腫瘤的形成中扮演重要角色，并參與腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移。Meng 等〔7，8〕最早發(fā)現(xiàn)，miR-21可以在膽管癌、肝癌細(xì)胞中作用于腫瘤抑制基因PTEN 并促進(jìn)腫瘤細(xì)胞侵襲和遷移，證明PTEN是 miR-21的靶基因，后陸續(xù)在非小細(xì)胞肺癌〔9〕和 乳腺癌〔10〕、胃癌〔11〕、卵巢癌〔12〕、腦膠質(zhì)瘤〔13〕、子宮內(nèi)膜癌〔14〕中被證明是miR-21 的靶基因。Meng等〔7〕在膽管癌的研究中，證明了抑癌基因PTEN是miR-21的一個(gè)靶基因，miR-21通過(guò)靶向作用于PTEN，促進(jìn)了膽管癌的生長(zhǎng)。Meng等〔8〕通過(guò)miRNA 表達(dá)譜研究發(fā)現(xiàn)人肝癌細(xì)胞中存在miR-21過(guò)高表達(dá)，而PTEN表達(dá)降低，兩者之間存在負(fù)相關(guān)趨勢(shì)，提示miR-21可能抑制PTEN的表達(dá)從而介導(dǎo)了腫瘤的進(jìn)展。抑制miR-21可增加PTEN 表達(dá)，減少肝癌細(xì)胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移，增強(qiáng)miR-21表達(dá)的作用則出現(xiàn)相反的腫瘤生物學(xué)效應(yīng)，表明PTEN是miR-21的直接靶基因，其參與了miR-21對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移的影響。Zhang等〔11〕發(fā)現(xiàn)，在胃癌細(xì)胞BGC-823中，miR-21可通過(guò)靶向PTEN促進(jìn)細(xì)胞的增殖和侵襲。許多研究已經(jīng)表明miR-21在CRC中高表達(dá)〔15～20〕，但miR-21在CRC中的具體調(diào)節(jié)機(jī)制尚不明了。miRNA 具有調(diào)節(jié)下游靶基因表達(dá)的作用，因此在大多腫瘤中高表達(dá)的miR-21 很可能是通過(guò)調(diào)節(jié)同增殖、凋亡、侵襲或遷移相關(guān)基因的表達(dá)而發(fā)揮促進(jìn)腫瘤發(fā)生發(fā)展的作用。

本研究先通過(guò)生物信息學(xué)在線軟件查詢PTEN是miR-21的一個(gè)靶基因，后通過(guò)熒光素酶實(shí)驗(yàn)更加進(jìn)一步證實(shí)。抑制miR-21后，PTEN mRNA變化無(wú)差異，但PTEN蛋白則明顯增高，證明miR-21在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控PTEN表達(dá)。抑制miR-21后，PTEN其下游的PI3K、AKT、mTOR、MMP-9水平均降低。miR-21改變了病灶中黏附激酶的磷酸化和金屬蛋白酶2和9(MMP-2、MMP-9)的表達(dá)，進(jìn)而抑制了其下游的遷移和浸潤(rùn)。證明miR-21可通過(guò)對(duì)PTEN的調(diào)控進(jìn)而影響PI3K/AKT/ mTOR信號(hào)通路下游的靶點(diǎn)蛋白的表達(dá)。但也有不一致的報(bào)道，Medina 等〔21〕通過(guò)裸鼠試驗(yàn)證明僅僅過(guò)表達(dá)miR-21 就可引發(fā)腫瘤的發(fā)生， Hatley 等〔22〕卻通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)證明miR-21 過(guò)表達(dá)并不能導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生，在非小細(xì)胞肺癌中PTEN并非miR-21的靶標(biāo)。Cheng等〔23〕報(bào)道在HeLa細(xì)胞中抑制miR-21時(shí)，HeLa細(xì)胞會(huì)顯著加快生長(zhǎng)。Si等〔24〕在乳腺癌細(xì)胞MCF-7中的研究發(fā)現(xiàn)，MCF-7細(xì)胞中miR-21與PTEN并不存在這樣的調(diào)節(jié)關(guān)系。Folini等〔25〕研究發(fā)現(xiàn)敲除前列腺癌細(xì)胞中miR-21表達(dá)，不影響其增值、侵襲能力和放化療敏感性，也不調(diào)節(jié)腫瘤抑制因子PTEN、PDCD-4的表達(dá)，也發(fā)現(xiàn)miR-21在前列腺癌組織和相應(yīng)的正常組織表達(dá)也沒(méi)有差異。表明miR-21的致癌屬性存在細(xì)胞和組織依賴性。特定的miRNA作為治療靶點(diǎn)應(yīng)該考慮疾病的有關(guān)環(huán)境背景。Wang等〔26〕發(fā)現(xiàn)miR-21在 Cdc25A過(guò)表達(dá)的結(jié)腸癌細(xì)胞中低表達(dá)。原因可能在于組織樣本的數(shù)量和質(zhì)量，或者特定的細(xì)胞株或者培養(yǎng)條件。這表明miRNAs可能參與許多與腫瘤形成、炎癥、細(xì)胞生長(zhǎng)密切相關(guān)的信號(hào)途徑，形成一個(gè)復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)?？梢?jiàn)，人們對(duì)miR-21 的作用及其與PTEN 的關(guān)系還沒(méi)有達(dá)成共識(shí)，故需要進(jìn)一步研究。

參考文獻(xiàn)4

1Jemal A，Siegel R，Xu J，etal.Cancer statistics，2010〔J〕.CA Cancer J Clin，2010；60(5)：277-300.

2Yang L，Parkin DM，Li L，etal.Time trends in cancer mortality in China：1987-1999〔J〕.Int J Cancer，2003；106(5)：771-83.

3Manikandan J，Aarthi JJ，Kumar SD，etal.Oncomirs：the potential role of non-coding microRNAs in understanding cancer〔J〕.Bioinformation，2008；2(8)：330-4.

4Cho WC.OncomiRs：the discovery and progress of microRNAs in cancers〔J〕.Mol Cancer，2007；6(1)：60 .

5Li J，Yen C，Liaw D，etal.PTEN，a putative protein tyrosine phosphatase gene mutated in human brain，breast，and prostate cancer〔J〕.Science，1997；275(5308)：1943-7.

6Sansal I，Sellers WR.The biology and clinical relevance of the PTEN tumor suppressor pathway〔J〕.J Clin Oncol，2004；22 (14)：2954-63.

采用口服自擬中藥湯劑降脂湯，方劑如下：黃芪30 g、生大黃6 g、白芍15 g、草決明20 g、山楂20 g、澤瀉10 g、紅花15 g、炒白術(shù)20 g，茯苓20 g，枳實(shí)10 g、丹參20 g，肝腎虧虛加：何首烏10 g、女貞子10 g、桑寄生15 g、杜仲10 g；脾虛痰濕加：半夏6 g、膽南星10 g、薏苡仁20 g、山藥10 g；氣滯血瘀加：紅花10 g、桃仁10 g、當(dāng)歸10 g、陳皮15 g。

7Meng F，Henson R，Lang M，etal.Involvement of human micro-RNA in growth and response to chemotherapy in human cholangiocarcinoma cell lines〔J〕.Gastroenterology，2006；130(7)：2113-29.

8Meng F， Henson R，Wehbe-Janek H，etal.MicroRNA-21 regulates expression of the PTEN tumor suppressor gene in human hepatocellular cancer〔J〕.Gastroenterology，2007；133(2)：647-58.

9Zhang JG，Wang JJ，Zhao F，etal.MicroRNA-21 (miR-21) represses tumor suppressor PTEN and promotes growth and invasion in non-small cell lung cancer (NSCLC) 〔J〕.Clin Chim Acta，2010；411(11-12)：846-52.

10Wang ZX，Lu BB，Wang H，etal.MicroRNA-21 modulates chemosensitivity of breast cancer cells to doxorubicin by targeting PTEN〔J〕.Arch Med Res，2011；42(4)：281-90.

11Zhang BG，Li JF，Yu BQ，etal.microRNA-21 promotes tumor proliferation and invasion in gastric cancer by targeting PTEN〔J〕.Oncol Rep，2012；27(4)：1019-26.

12Lou Y，Yang X，Wang F，etal.MicroRNA-21 promotes the cell proliferation，invasion and migration abilities in ovarian epithelial carcinomas through inhibiting the expression of PTEN protein〔J〕.Int J Mol Med,2010；26(6)：819-27.

13Zhou X，Ren Y，Moore L，etal.Downregulation of miR-21 inhibits EGFR pathway and suppresses the growth of human glioblastoma cells independent of PTEN status〔J〕.Lab Invest,2010；90(2)：144-55.

15Xiong BH，Cheng Y，Ma L，etal.MiR-21 regulates biological behavior through the PTEN/PI-3K/Akt signaling pathway in human colorectal cancer cells[J].Int J Oncol，2013；42(1)：219-28.

16Kulda V，Pesta M，Topolcan O，etal.Relevance of miR-21 and miR-143 expression in tissue samples of colorectal carcinoma and its liver metastases〔J〕.Cancer Genet Cytogenet，2010；200(2)：154-60.

17Fassan M，Pizzi M，Giacomelli L，etal.PDCD4 nuclear loss inversely correlates with miR-21 levels in colon carcinogenesis〔J〕.Virchows Arch，2011；458(4)：413-9.

18Liu K，Li G，F(xiàn)an C，etal.Increased expression of microRNA-21 and its association with chemotherapeutic response in human colorectal cancer〔J〕.J Int Med Res，2011；39(6)：2288-95.

19Drebber U，Lay M，Wedemeyer I，etal.Altered levels of the onco-microRNA 21 and the tumor-supressor microRNAs 143 and 145 in advanced rectal cancer indicate successful neoadjuvant chemoradiotherapy〔J〕.Int J Oncol，2011；39(2)：409-15.

20Chang KH，Miller N，Kheirelseid EA，etal.MicroRNA-21 and PDCD4 expression in colorectal cancer〔J〕.Eur J Surg Oncol，2011；37(7)：597-603.

21Medina PP，Nolde M，Slack FJ，etal.OncomiR addiction in an in vivo model of microRNA-21-induced pre-B-cell lymphoma〔J〕.Nature，2010；467(7311)：86-90.

22Hatley ME，Patrick DM，Garcia MR，etal.Modulation of K-Ras-dependent lung tumorigenesis by MicroRNA-21〔J〕.Cancer Cell，2010；18(3)：282-93.

23Cheng AM，Byrom MW，Shelton J，etal.Antisense inhi bition of human miRNAs and indications for an involvement of miRNA in cell growth and apoptosis〔J〕.Nucleic Acids Res，2005；33(4)：1290-7.

24Si ML，Zhu S，Wu H，etal.miR-21-mediated tumor growth〔J〕.Oncogene，2007；26 (19)：2799-803.

25Folini M，Gandellini P，Longoni N，etal.miR-21，an oncomir on strike in prostate cancer〔J〕.Mol Cancer，2010；9(1)：12.

26Wang P，Zou F，Zhang X，etal.MicroRNA-21 negatively regulates Cdc25A and cell cycle progression in colon cancer cells〔J〕.Cancer Res，2009；69(20)：8157-65.

〔2014-06-17修回〕

(編輯安冉冉/曹夢(mèng)園)

《中國(guó)老年學(xué)雜志》被國(guó)內(nèi)數(shù)家數(shù)據(jù)庫(kù)、檢索性期刊檢索機(jī)構(gòu)收錄情況

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The expression and function research of MicroRNA-21(miR-21) in colorectal cell lines

XIONG Bing-Hong, MA Li, CHENG Yong,etal.

Department of General Surgery, the First Affiliated Hospital of Chongqing Medical University, Key Laboratory of General Surgery of Chongqing City, Chongqing 400016, China

【Abstract】ObjectiveTo explore the expression of miRNA-21 ( miR-21) in colorectal cancer (CRC), discuss the potential role of miR-21 playing on target mRNA regulation.MethodsThe ASO technology was employed to suppress the expression of miR-21 in HCT116 cells. The changes in PTEN, PI3K, Akt, MMP-9, mTOR mRNA and protein expressions were detected by FQ-PCR and Western blot respectively. The potential target mRNA prediction was performed by Bioinformatics. Dual report gene assay was used to identify the target gene of miR-21.ResultsThe level of miR-21 was the highest in HCT116 cell, lowest in SW480 cell. The suppression of miR-21 could lead to the increment of PTEN protein, the down-regulation of PI3K, Akt, MMP-9 and mTOR. PTEN was identified as one of target genes of miR-21 in CRC cell.ConclusionsmiR-21 is over-expressed in CRC and can promot cancer cell invasion by inhibiting the expression level of PTEN.

【Key words】Colorectal cancer; miR-21; Tumor suppressor gene; PTEN; Akt; MMP-9

中圖分類號(hào)〔〕R735.3〔

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼〕A〔

文章編號(hào)〕1005-9202(2015)23-6688-04；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2015.23.019