CREST與MMP-2、MMP-9在乳腺癌侵襲轉(zhuǎn)移中的作用及關(guān)系

任甜甜　王巧真　周風(fēng)華　田紅艷　陳萍萍　呂世軍

(濰坊醫(yī)學(xué)院病理學(xué)教研室，山東　濰坊　261053)

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CREST與MMP-2、MMP-9在乳腺癌侵襲轉(zhuǎn)移中的作用及關(guān)系

任甜甜王巧真1周風(fēng)華田紅艷陳萍萍呂世軍

(濰坊醫(yī)學(xué)院病理學(xué)教研室，山東濰坊261053)

摘要〔〕目的觀察鈣反應(yīng)性反式激活因子(CREST)、MMP-2、基質(zhì)金屬蛋白酶-9(MMP-9)在不同TNM分期乳腺癌組織中的表達(dá)及其與乳腺癌侵襲、轉(zhuǎn)移的關(guān)系。方法乳腺癌組織90例，蘇木素-伊紅(HE)染色確定組織學(xué)類型、組織學(xué)分級(jí)，結(jié)合臨床資料確定TNM分期，分為乳腺癌TNMⅠ期20例，Ⅱ期40例，Ⅲ期30例，分別應(yīng)用免疫組織化學(xué)SP法檢測(cè)CREST、MMP-2、MMP-9蛋白在乳腺癌組織不同TNM分期的表達(dá)；RT-PCR和Western 印跡檢測(cè)CREST在mRNA和蛋白水平的變化，分析三者的相關(guān)性及其與TNM分期的關(guān)系。結(jié)果CREST、MMP-2、MMP-9蛋白在TNMⅢ期乳腺癌中的陽性表達(dá)率明顯高于TNMⅠ、Ⅱ期，且在TNMⅡ期乳腺癌中的陽性表達(dá)率明顯高于TNMⅠ(P均<0.05),且三者的表達(dá)呈正相關(guān)(P均<0.05)。CREST mRNA在TNMⅢ期乳腺癌中的相對(duì)表達(dá)量明顯高于TNMⅠ、Ⅱ期，在TNMⅡ期乳腺癌中的相對(duì)表達(dá)量明顯高于TNMⅠ(P均<0.05)。CREST和MMP-2、MMP-9的高表達(dá)均與分化程度有關(guān)(P均<0.05)，而與患者的年齡無關(guān)(P>0.05)。結(jié)論乳腺癌中CREST、MMP-2、MMP-9的高表達(dá)可能與其侵襲、轉(zhuǎn)移有關(guān)，聯(lián)合檢測(cè)三者的表達(dá)，對(duì)乳腺癌預(yù)后判斷可能有指導(dǎo)作用。

關(guān)鍵詞〔〕乳腺腫瘤；CREST；MMP-2；MMP-9；侵襲；轉(zhuǎn)移

1濰坊醫(yī)學(xué)院人體解剖學(xué)教研室

第一作者：任甜甜 (1989-)，女，在讀碩士，主要從事乳腺癌病理學(xué)研究。

我國乳腺癌的發(fā)病率和死亡率呈逐年上升趨勢(shì)，且逐漸年輕化〔1〕。基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)中的MMP-2、MMP-9可促進(jìn)新生血管發(fā)生，在腫瘤的浸潤轉(zhuǎn)移中起重要作用〔2〕。CREST是Aizawa〔3〕于2004年鑒定出一種反式激活因子，序列分析證實(shí)，CREST與SYT原癌基因有高度的同源性，原癌基因的激活可以導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生，在滑膜肉瘤中，就有56%的氨基酸序列同源，在滑膜肉瘤中存在CREST基因的突變〔4〕，但在乳腺癌中的表達(dá)并不清楚。本文旨在探討CREST、MMP-2、MMP-9的表達(dá)水平，觀察并分析三者的相關(guān)性及與乳腺癌侵襲轉(zhuǎn)移的關(guān)系。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1病例資料收集濰坊醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院2013年乳腺癌手術(shù)送檢標(biāo)本90例，<55歲68例，≥55歲22例，術(shù)前均未接受任何治療，有完整的臨床資料，病理診斷結(jié)果均經(jīng)兩名以上病理副主任醫(yī)師確認(rèn)，結(jié)合臨床資料并按照AJCC乳腺癌臨床分期標(biāo)準(zhǔn)(2003)，TNMⅠ期20例，Ⅱ期40例，Ⅲ期30例。分化程度：低分化48例，高分化42例。將標(biāo)本分為兩份，一份常規(guī)石蠟切片包埋，做免疫組化；另一份新鮮標(biāo)本置于液氮中保存，留做RT-PCR和Western印跡。

1.1.2主要試劑兔抗人CREST多克隆抗體購自武漢三鷹試劑有限公司，兔抗人MMP-2多克隆抗體、兔抗人MMP-9多克隆抗體、檸檬酸鹽緩沖液、DAB 顯色試劑盒、PV9000通用型兩步法檢測(cè)試劑盒均購自北京中杉金橋公司。RevertAidTM M-MuLV逆轉(zhuǎn)錄酶購自Fermentas公司，Trizol試劑購自美國Invitrogen公司， Taq DNA聚合酶購自上海生物工程有限公司。

1.2方法

1.1.2免疫組織化學(xué)方法石蠟組織標(biāo)本4 μm厚連續(xù)切片4張，60℃烤片2 h。二甲苯脫蠟、梯度酒精脫水后充分水洗。一抗CREST、MMP-9的濃度均為1∶100，MMP-2為工作液，按照PV9000通用型二步法試劑盒說明書進(jìn)行操作，用磷酸鹽緩沖液(PBS)代替一抗作陰性對(duì)照。DAB顯色后蘇木精復(fù)染。在光學(xué)顯微鏡下隨機(jī)選取5個(gè)視野，計(jì)數(shù)500個(gè)細(xì)胞，陽性細(xì)胞率為陽性細(xì)胞占同類計(jì)數(shù)細(xì)胞的百分比。陽性結(jié)果根據(jù)陽性細(xì)胞的染色強(qiáng)度和百分率來判斷。細(xì)胞染色強(qiáng)度和陽性率計(jì)分標(biāo)準(zhǔn)參照本課題組人員劉菲等〔5〕的研究。

1.2.2RT-PCR方法用Trizol試劑提取所有組織的總RNA，用紫外分光光度計(jì)測(cè)其濃度，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以1 μl逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板，Taq酶PCR MasterMix 10 μl，按照說明書要求進(jìn)行PCR擴(kuò)增。CREST上游引物序列：5′-CCACCTCCATGAGCATCTCT-3′，下游引物序列：5′-TGGTCCGAGACACGTAGTTG-3′，擴(kuò)增產(chǎn)物片段長(zhǎng)度為108 bp，引物序列由上海生物工程有限公司設(shè)計(jì)并合成。PCR反應(yīng)條件為：95℃ 預(yù)變性3 min，95℃ 30 s，55℃退火 30 s，72℃ 延伸30 s，擴(kuò)增30個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸 7 min終止反應(yīng)。分別取擴(kuò)增產(chǎn)物及內(nèi)參照(β-actin)各5 μl，在 1.5% 瓊脂糖凝膠上電泳130 V，30 min。

1.2.3Western印跡實(shí)驗(yàn)將適量不同TNM分期乳腺癌組織加入裂解液置于冰上勻漿研磨后取上清，用BCA法檢測(cè)蛋白濃度。各分期以等量蛋白經(jīng)12%SDS-PAGE電泳進(jìn)行分離后，按200 mA，1.5 h的條件轉(zhuǎn)至PVDF膜，奶粉封閉后加入一抗和二抗，用化學(xué)發(fā)光劑顯影，X線膠片曝光。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理應(yīng)用IPP5.1圖像分析軟件測(cè)量RT-PCR和Western印跡顯示條帶的累積光密度(IOD)值，并進(jìn)行目的條帶與β-actin累積光密度比值計(jì)算、分析。采用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS 17.0進(jìn)行χ2檢驗(yàn)、t檢驗(yàn)和Spearman等級(jí)相關(guān)系數(shù)檢驗(yàn)。

2結(jié)果

2.1CREST在乳腺癌組織中的表達(dá)(1)免疫組化結(jié)果：CREST蛋白陽性染色定位于乳腺癌細(xì)胞核 ，TNMⅠ、Ⅱ、Ⅲ期乳腺癌中，癌細(xì)胞CREST陽性表達(dá)率分別為25.0%(15/20)、52.5%(19/40)和76.7%(7/30)。不同TNM分期間有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)，且高分化乳腺癌陽性表達(dá)率(40.5%，17例)與低分化乳腺癌陽性表達(dá)率(66.7%，16例)相比， 有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。(2)RT-PCR結(jié)果：與TNMⅠ期乳腺癌相比，TNMⅡ、Ⅲ期乳腺癌CRESTmRNA水平明顯升高(TNMⅠ期為0.19，Ⅱ期為0.42，Ⅲ期為0.76)(P<0.05)。(3)Western印跡結(jié)果：與TNMⅠ期乳腺癌相比，TNMⅡ、Ⅲ期乳腺癌CREST蛋白水平明顯升高(TNMⅠ期為0.21，Ⅱ期為0.54，Ⅲ期為0.88)(P<0.05)，見圖1。

2.2MMP-2、MMP-9在乳腺癌組織中的表達(dá)圖2可見，MMP-2、MMP-9蛋白陽性染色主要定位于細(xì)胞質(zhì)，在部分間質(zhì)細(xì)胞和細(xì)胞膜也表達(dá)。90例乳腺癌組織中，TNMⅠ、Ⅱ、Ⅲ期乳腺癌MMP-2陽性表達(dá)率分別為35.0%(7例)、57.5%(23例)和 83.3%(25例)，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)，且高分化乳腺癌陽性表達(dá)率(47.6%，20例)與低分化乳腺癌陽性表達(dá)率(72.9%，35例)相比， 有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)；TNMⅠ、Ⅱ、Ⅲ期乳腺癌MMP-9陽性表達(dá)率分別為30.0%(6例)、62.5%(25例)和86.7%(26例)，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)，且高分化乳腺癌陽性表達(dá)率(45.2%，19例)與低分化乳腺癌陽性表達(dá)率(79.1%，38例)相比， 有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。經(jīng)Spearman等級(jí)相關(guān)系數(shù)檢驗(yàn)顯示，CREST、MMP-2和MMP-9三個(gè)因子在乳腺癌中的表達(dá)呈正相關(guān)(P<0.05)，見表1。

圖1　CREST在乳腺癌中的表達(dá)

圖2　免疫組化染色示MMP-2、MMP-9在乳腺癌中的表達(dá)

2.3乳腺癌組織中MMP-2、MMP-9和CREST的表達(dá)與臨床病理特征之間的關(guān)系CREST、MMP-2、MMP-9的高表達(dá)均與乳腺癌的TNM分期、分化程度有密切關(guān)系(P均<0.05)，而與患者的年齡無關(guān)(P>0.05)，其中<55歲MMP-2陽性40例，MMP-9陽性44例，CREST陽性38例；≥55歲者M(jìn)MP-2陽性15例，MMP-9陽性13例，CREST陽性11例。

表1乳腺癌中CREST表達(dá)與MMP-2、MMP-9表達(dá)的相關(guān)性

nCREST高表達(dá)低表達(dá)r值P值MMP-2 高表達(dá)5540150.2720.010 低表達(dá)351619MMP-9 高表達(dá)5242100.4470.000 低表達(dá)381424

3討論

乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展、浸潤和轉(zhuǎn)移是一個(gè)多步驟、多因素調(diào)控的復(fù)雜過程，約25%～30%的早期患者都將發(fā)展成遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移〔6〕。腫瘤轉(zhuǎn)移是指惡性腫瘤細(xì)胞從原發(fā)病灶脫離，經(jīng)過各種信號(hào)途徑，到達(dá)遠(yuǎn)處的器官或組織，并在該部位繼續(xù)生長(zhǎng)、增殖而形成新病灶的過程〔2〕。侵襲轉(zhuǎn)移是關(guān)系到患者預(yù)后最主要的生物學(xué)特征，因此抑制腫瘤的浸潤轉(zhuǎn)移是提高乳腺癌患者生活質(zhì)量，延長(zhǎng)患者中位生存期的關(guān)鍵。

CREST是一種與突觸結(jié)合蛋白(SYT)相關(guān)的核蛋白，由3個(gè)主要結(jié)構(gòu)域組成：①起自動(dòng)調(diào)整功能的N-末端；②內(nèi)部富含甲硫氨酸序列的多功能結(jié)構(gòu)域，參與同源二聚體的形成，核小體的定位和轉(zhuǎn)錄因子的反式激活；③富含谷氨酰胺序列的C-末端，缺失分析證實(shí)核小體靶向結(jié)合位點(diǎn)位于CREST的C-末端，它與cAMP的效應(yīng)結(jié)合蛋白(CBP)和P300相互作用，介導(dǎo)鈣誘導(dǎo)的反式激活〔3〕。

CREST 蛋白的N-末端能夠靶向結(jié)合Brg-1，形成CREST- Brg-1復(fù)合物，對(duì)CREST介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)起負(fù)反饋?zhàn)饔谩?〕。已有研究表明，Brg-1的缺失與人類惡性腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)，認(rèn)為Brg-1 是潛在的腫瘤抑制基因，并且已經(jīng)證實(shí)Brg-1在乳腺癌中呈低表達(dá)狀態(tài)〔8～11〕，因此我們推測(cè)Brg-1的低表達(dá)可能會(huì)導(dǎo)致CREST蛋白的高表達(dá)，所以我們采用免疫組化和RT-PCR來測(cè)定乳腺癌組織中CREST蛋白和mRNA的表達(dá)水平，實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)了這一推測(cè)，但CREST和Brg-1之間相互作用的具體機(jī)制尚不清楚。

MMPs是一組肽鏈內(nèi)切酶，目前發(fā)現(xiàn)已有23種，MMP-2、MMP-9是基質(zhì)金屬蛋白酶家族中最重要的兩種蛋白水解酶，因其細(xì)胞外基質(zhì)中的Ⅳ型膠原為其反應(yīng)底物，故又稱為Ⅳ型膠原酶〔12〕。腫瘤細(xì)胞以酶原的形式分泌MMP-2、MMP-9，水解后激活形成膠原酶并降解基底膜的主要成分Ⅳ型膠原和明膠，然后腫瘤細(xì)胞沿著此缺失的基底膜向周圍組織和器官浸潤，最終導(dǎo)致腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果可認(rèn)為CREST在乳腺癌的發(fā)生發(fā)展中起重要作用，CREST蛋白的高表達(dá)可以作為判定乳腺癌侵襲轉(zhuǎn)移的重要分子標(biāo)志。

綜上，由于淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和組織浸潤是影響患者預(yù)后的重要因素，因此可聯(lián)合檢測(cè)三者的表達(dá)水平，為惡性腫瘤的靶向治療提供新的參考依據(jù)。但是CREST和MMP-2、MMP-9協(xié)同促進(jìn)腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的具體機(jī)制尚不明了，需要我們進(jìn)一步研究。

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〔2015-08-11修回〕

(編輯李相軍)

Effect and relationship of CREST, MMP-2 and MMP-9 in the invasion and metastasis of breast cancer

REN Tian-Tian,WANG Qiao-Zhen,ZHOU Feng-Hua,etal.

Department of Pathology in Weifang Medical College,Weifang 261053,Shandong, China

【Abstract】ObjectiveTo observe the expressions of CREST, MMP-2 and MMP-9 in different TNM stage of breast cancer and explore the relationship with the invasion and metastasis of breast cancer.MethodsCases of breast cancer of TNM Ⅰ, Ⅱand Ⅲ stage were 30%, 40%, 30% respectively.The expressions of CREST, MMP-2 and MMP-9 were evaluated in breast cancer tissues by immunohistochemistry, the expression of CREST mRNA was examined by RT-PCR，and Western blot was used to analyze the protein of CREST.ResultsThe levels of CREST, MMP-2 and MMP-9 were overexpressed in breast cancer tissues.The expressions of CREST, MMP-2 and MMP-9 in TNM Ⅲ stage of breast cancer tissues were significantly higher than those in TNMⅠand Ⅱstage of breast cancer tissues(all P<0.05).The overexpressions of CREST, MMP-2 and MMP-9 were dramatically associated with degree of differentiation (all P<0.05), but were not associated with patients′ age(all P<0.05).ConclusionsThe overexpressions of CREST, MMP-2 and MMP-9 could be correlated with invasion and metastasis of breast cancer tissues, detection of the expressions of these three proteins might provide a new index for evaluating the prognosis of breast cancer.

【Key words】Breast cancer;CREST;MMP-2;MMP-9;Invasion;Metastasis

通訊作者：呂世軍(1961-)，男，博士，教授，碩士生導(dǎo)師，主要從事乳腺腫瘤研究。

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81472365；ZR2014HM086；ZR2014HL077)；山東省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(ZR2010HM087)；山東省教育廳課題(J12LK51) ；山東省衛(wèi)生廳課題(2013WS0279)；濰坊市科技局課題(201302089)

中圖分類號(hào)〔〕R361+.2〔

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼〕A〔

文章編號(hào)〕1005-9202(2015)23-6700-03；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2015.23.024