芬太尼與5-氟尿嘧啶聯合誘導MCF-7乳腺癌細胞凋亡及其機制

王志學　張曉俠　雷　燕　劉新偉　李汝泓

(承德醫學院附屬醫院麻醉科，河北　承德　067000)

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芬太尼與5-氟尿嘧啶聯合誘導MCF-7乳腺癌細胞凋亡及其機制

王志學張曉俠雷燕1劉新偉李汝泓

(承德醫學院附屬醫院麻醉科，河北承德067000)

摘要〔〕目的研究芬太尼與5-氟尿嘧啶(FU)聯合應用對MCF-7乳腺癌細胞凋亡的影響及內、外源性途徑的調控機制。方法作用48 h后通過流式細胞技術(FCM)檢測Annexin V-EGFP/PI染色的細胞凋亡情況，通過免疫細胞化學檢測Bcl-2、Bax、Fas表達情況。結果單獨應用芬太尼時1 μmol/L與10 μmol/L濃度組凋亡率均增加(P<0.05，P<0.01)，Bcl-2表達減弱(P<0.05，P<0.01)、Bax表達增強(P<0.01)、Fas表達增強(P<0.01)；單獨應用500 μmol/L 5-FU后凋亡率亦明顯增加(P<0.01)，Bcl-2表達減弱(P<0.01)、Bax、Fas表達增強(P<0.01)；聯合應用芬太尼與5-FU，協同作用在3組均顯現(P<0.05，P<0.01)。結論芬太尼、5-FU在一定濃度范圍內單獨或聯合應用可促進MCF-7乳腺癌細胞凋亡，并使Bcl-2表達下調，Bax、Fas表達上調。聯合應用兩類藥物可能在內源性、外源性途徑調控細胞凋亡上顯示協同效應。

關鍵詞〔〕芬太尼；5-氟尿嘧啶；MCF-7；凋亡；Bcl-2；Bax；Fas

1承德醫學院附屬醫院手術部

第一作者：王志學(1978-)，男，醫學碩士，主治醫師，講師，主要從事癌痛治療對腫瘤生物學行為影響方面的研究。

綜合治療乳腺癌的研究中，人們更關注用于癌痛治療的阿片類藥物對化療藥物抗腫瘤作用的影響。筆者前期的一些研究證實〔1～6〕，單獨或聯合應用嗎啡、5-氟尿嘧啶(FU)，在一定濃度范圍內能抑制MCF-7乳腺癌細胞增殖；聯合應用兩類藥物，可通過在細胞周期G0/G1期到S期轉化的抑制、S期向G2M期轉化的抑制上表現出對細胞周期影響的協同效應；單獨或聯合應用嗎啡、5-FU，在一定濃度范圍內可促進MCF-7乳腺癌細胞凋亡，并使Bcl-2表達下調，Bax、Fas、Caspase-8表達上調，聯合應用兩類藥物可能在內源性、外源性途徑調控細胞凋亡上顯示協同效應。同為阿片類藥物的芬太尼，因為具有更多的劑型和工藝不斷出現，近年來更多地用于癌痛治療。以往的研究指出〔7～9〕，其也能劑量依賴性地抑制MCF-7人乳腺癌細胞增殖、促進其凋亡，并能使腫瘤細胞所致的組織破壞顯著減少。然而，芬太尼與5-FU聯合應用是否也有嗎啡類似的效應尚有待闡明。對于此，筆者前期也做了相關實驗〔10〕。本文將對芬太尼與5-FU聯合應用對凋亡的影響以及內、外源性途徑的機制進行相關探討。

1材料和方法

1.1材料

1.1.1主要試劑和儀器PI(碘化丙啶)，Sigma公司(美國)；Annexin V-EGFP，凱基公司(南京)；胎牛血清、胰蛋白酶，天津血液學研究所；RPMI1640培養基，GIBCOBRL公司(美國)；鼠抗人Bcl-2、Bax、Fas免疫化學單克隆抗體，邁新公司(福州)。FACSCalibur流式細胞儀，B&D公司(美國)； YT-CJ-1N超凈工作臺，亞泰科隆實驗科技開發中心(北京)； CO2電熱恒溫培養箱， SANYO公司(日本)； LD5-IA低速離心機、QL-901振蕩器，雷勃爾公司(北京)；倒置顯微鏡、光學顯微鏡，OLYMPUS(日本)；數碼攝像系統、顯微采圖系統、熒光倒置顯微鏡，尼康(日本)； Mivnt顯微圖像分析系統，微宇公司(珠海)。

1.1.2實驗藥物5-FU注射液，旭東海普藥業(上海)；枸櫞酸芬太尼注射液，人福藥業(宜昌)。

1.1.3實驗細胞MCF-7人乳腺癌細胞，凱基公司(南京)。

1.2方法

1.2.1細胞培養成功復蘇細胞后，調整其濃度為1×106/ml，于培養瓶接種，在5%CO2、溫度37℃、濕度100%的電熱恒溫培養箱內靜置，以RPMI1640完全培養液培養，并隔日更換培養液。待觀察到70%～80%貼壁時，用0.25%胰蛋白酶消化并進行傳代。

1.2.2實驗分組MCF-7細胞分別用含不同種類或濃度實驗藥物的RPMI1640完全培養液培養，共分為8組：僅以RPMI1640培養液培養即未處理組(U組)，含0.1 μmol/L(低濃度)芬太尼的培養液處理組(LF組)，含1 μmol/L(中濃度)芬太尼的培養液處理組(MF組)，含10 μmol/L(高濃度)芬太尼的培養液處理組(HF組)，含500 μmol/L 5-FU的培養液處理組(FU組)，含0.1 μmol/L(低濃度)芬太尼與500 μmol/L 5-FU的培養液聯合處理組(LF+FU組)，含1 μmol/L(中濃度)芬太尼與500 μmol/L 5-FU的培養液聯合處理組(MF+FU組)，含10 μmol/L(高濃度)芬太尼與500 μmol/L 5-FU的培養液聯合處理組(HF+FU組)。

1.2.3FCM檢測Annexin V-EGFP/ PI染色的細胞凋亡情況取處于對數生長期的MCF-7細胞，將其濃度調整為5×105/ml，在25 ml細胞培養瓶中接種，觀察細胞貼壁后，用含不同種類或濃度實驗藥物的RPMI1640培養液5 ml換液(見1.2.2)，孵育48 h，每組5瓶。48 h后將上清吸棄，細胞消化、PBS洗滌，在離心管中收集約106/ml以上的細胞；4℃ 1 500 r/min低速離心5 min后將上清棄去， 以500 μl的Binding緩沖液重懸，再加入Annexin V-EGFP 5 μl及PI 5 μl，混勻，在室溫避光反應15 min；后1 h內上機用流式細胞儀檢測。

1.2.4細胞免疫化學檢測Bcl-2、Bax、Fas表達另取處于對數生長期的MCF-7細胞，將其制備為單細胞懸液，準確計數，調整到約為4×105/ml的細胞濃度，在1 cm×1 cm蓋玻片(已預先置于培養皿中)上接種，每片0.5 ml。觀察貼壁后，向培養皿中分別加入含不同種類或濃度實驗藥物的RPMI1640培養液(見1.2.2)孵育48 h。48 h后4℃丙酮固定大于20 min、自然風干，PBS沖洗；50 μl 13%過氧化氫孵育，PBS再沖洗；然后用50 μl血清封閉20 min。除去血清，加50 μl一抗，4℃過夜，次日PBS沖洗。加50 μl二抗，室溫環境下孵育15～20 min后PBS沖洗。加100 μl新鮮配制的DAB溶液，在顯微鏡下觀察3～5 min。蘇木素復染，返藍，梯度酒精脫水干燥，二甲苯透明，中性樹膠封固。用Nikon Eclipse 50i顯微采圖系統對染色后載玻片上的Bcl-2、Bax、Fas免疫陽性物進行采圖，再以MiVnt顯微圖像分析系統對其定量分析。每個對照組或實驗組測量5張玻片，200倍鏡下對每張玻片隨機選取5個不同視野成像，檢測其平均灰度級，即代表1張玻片上陽性細胞平均灰度(AGL)。AGL數值越大，蛋白表達水平越低。

1.3統計學分析采用SPSS11.5軟件進行單因素方差分析與析因設計方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗。

2結果

2.1凋亡率變化情況與U組相比，1 μmol/L及10 μmol/L的芬太尼單獨處理48 h凋亡率均增加(P<0.05，P<0.01)；500 μmol/L 5-FU單獨處理48 h，凋亡率亦增加(P<0.01)。聯合應用不同濃度芬太尼與500 μmol/L 5-FU 處理48 h，較各自單獨處理組相比，凋亡率亦均明顯增加(P<0.01)，且均顯示出協同效應(P<0.01)；隨其中芬太尼濃度增加，凋亡率依次增加。見表1。

2.2免疫細胞化學染色檢測Bcl-2、Bax、Fas蛋白表達情況免疫細胞化學染色檢測Bcl-2蛋白表達時，U組的絕大多數細胞質可見棕黃色的染色，數據顯示為最小的AGL、最強的Bcl-2表達。芬太尼單獨處理48 h，胞質棕黃色染色隨著芬太尼濃度的增加依次減淺、AGL隨之增加。免疫細胞化學染色檢測Bax蛋白表達時，U組的絕大多數細胞質可見棕黃色染色不明顯，數據顯示為最大的AGL、最弱的Bax表達。芬太尼單獨處理48 h，胞質棕黃色染色隨著芬太尼濃度的增加依次加深、AGL隨之降低。免疫細胞化學染色檢測Fas蛋白表達時，U組的絕大多數細胞質可見棕黃色染色不明顯，數據顯示為最大的AGL、最弱的Fas表達。芬太尼單獨處理48 h，胞質棕黃色染色隨著芬太尼濃度的增加依次加深、AGL隨之降低。與U組相比，1 μmol/L及10 μmol/L濃度的芬太尼均能減弱Bcl-2表達、增強Bax、Fas表達(P<0.01)。500 μmol/L 5-FU單獨處理48 h，與未處理組相比亦能減弱Bcl-2表達、增強Bax、Fas表達(P<0.01)。聯合應用不同濃度芬太尼與500 μmol/L 5-FU處理48 h，較各自單獨處理組相比，均能明顯減弱Bcl-2表達、增強Bax、Fas表達(P<0.01)，且均顯示出協同效應(P<0.05)；且隨其中芬太尼濃度增加，Bcl-2表達依次減弱，Bax、Fas表達依次增強。見表1。

組別細胞凋亡率(%)Bcl-2AGLBaxAGLFasAGLU組3.394±0.900144.183±3.903260.783±20.622270.654±13.213LF組3.682±0.939148.490±4.025256.072±7.252268.411±14491MF組5.040±0.6981)164.191±8.7531)219.307±12.3582)228.099±9.1712)HF組9.020±1.0652)194.176±8.2642)197.957±9.7442)194.626±11.3282)LF+FU組18.352±2.1192)3)5)224.226±17.4322)3)4)156.639±12.2262)3)4)161.199±10.6072)3)4)MF+FU組21.862±2.3612)3)5)245.779±33.9302)3)4)132.345±5.7892)3)4)131.814±6.8522)3)4)HF+FU組28.478±3.0862)3)5)266.635±26.7762)3)4)105.809±9.1962)3)4)100.329±4.6362)3)4)FU組12.210±1.7382)168.491±9.4932)191.380±12.0792)192.625±10.8002)

與U組相比：1)P<0.05，2)P<0.01；與相應單獨處理組相比：3)P<0.01；協同作用出現：4)P<0.05，5)P<0.01

3討論

阿片類藥物通過多種機制影響腫瘤細胞生長，芬太尼抑制腫瘤生長的機制之一即是誘導凋亡〔7～9〕。化療的代表藥物5-FU可通過多種途徑誘導腫瘤細胞凋亡亦早已證實。本研究發現，芬太尼、5-FU在一定濃度范圍內單獨或聯合應用可促進MCF-7乳腺癌細胞凋亡，并與其中芬太尼有明顯的劑量依賴關系，聯合應用兩類藥物顯示出協同效應。

誘導人類細胞凋亡主要有外源性凋亡途徑和內源性凋亡途徑兩種。外源性途徑是由細胞膜表面的死亡受體觸發，而內源性途徑包括Bcl-2家族蛋白調節線粒體膜完整性方面的改變，以及對細胞損害或應激信號做出的潛在反應。凋亡的發生與否還有賴于Bcl-2/Bax這對抗凋亡/促凋亡蛋白之間的平衡〔11〕。Bcl-2可穩定線粒體膜，防止細胞色素C進入胞質；而Bax恰恰相反。本實驗研究顯示，芬太尼、5-FU在一定濃度范圍內單獨或聯合應用均可顯著下調MCF-7乳腺癌細胞Bcl-2表達、上調Bax表達，兩藥聯合應用更顯示出協同效應。這也提示兩藥聯合應用可能是依賴線粒體途徑發揮協同作用促進細胞凋亡。另外，一旦細胞受到某些凋亡信號刺激，Fas被Fas-L占據后會導致受體聚合，向Fas表達的細胞內傳遞死亡信號，形成死亡誘導信號復合體〔12〕。本研究結果提示聯合應用兩藥也可能在通過死亡受體途徑促進細胞凋亡上發揮協同效應。以上結果顯示，兩藥聯合應用既能在內源性途徑、又能在外源性途徑發揮協同作用，更有利于觸發caspases級聯反應引起細胞凋亡〔13〕。

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〔2015-10-23修回〕

(編輯曲莉)

The Apoptosis in MCF-7 breast cancer cells induced by fentanyl in combination with 5-Fluouracil and the mechanism

WANG Zhi-Xue,ZHANG Xiao-Xia,LEI Yan,etal.

Department of Anesthesiology,the Affiliated Hospital of Chengde Medical College ,Chengde 067000,Hebei,China

【Abstract】ObjectiveTo investigate the effects of fentanyl in combination with 5-FU on apoptosis and the regulation mechanism of the intrinsic and extrinsic pathways in MCF-7 breast cancer cells.MethodsAfter treated with different concentration of fentanyl in combination with 5-FU for 48 h,the percentage of apoptotic cells was measured by FCM through Annexin V-EGFP/ PI staining,and the expressions of Bcl-2,Bax and Fas were detected by immunocytochemistry.ResultsAfter treated with 1 μmol/L as well as 10 μmol/L of fentanyl alone,the percentage of apoptosis and expressions of Bax and Fas were increased significantly(P<0.05,P<0.01),while the expression of Bcl-2 was decreased significantly(P<0.05，P<0.01).Similarly,the apoptosis rate and expressions of Bax and Fas also were increased remarkably(P<0.01),but the expression of Bcl-2 was decreased significantly(P<0.01),when cancer cells treated with 5-FU alone. Treated with different concentration of fentanyl combined with 5-FU,the apoptosis rate and expressions of Bax and Fas were increased more remarkably than those treated with two agents alone(P<0.01),meanwhile the expression of Bcl-2 was decreased significantly(P<0.01),including that there was a synergistic effects between fentanyl and 5-FU in induction of breast cancer cell apoptosis(P<0.05，P<0.01).ConclusionsCertain concentration of fentanyl,5-FU and the combination of the two agents could promote apoptosis of MCF-7 breast cancer cells,which result from significant down-regulating expression of Bcl-2 and up-regulating expression of Bax and activation of the intrinsic pathways. Combination of fentanyl and 5-FU shows synergisms effects.

【Key words】Fentanyl;5-Fluouracil;MCF-7;Apoptosis;Bcl-2；Bax；Fas

通訊作者：劉新偉(1973-)，男，副主任醫師， 主要從事麻醉藥理方面的研究。

中圖分類號〔〕R73-36；R34〔

文獻標識碼〕A〔

文章編號〕1005-9202(2015)23-6705-03；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2015.23.026