超氧化物歧化酶與L-精氨酸聯合預處理對大鼠肝缺血再灌注損傷的保護作用

鄧　放　趙不非　馬　躍　徐巖松　李　鵬　肖福斌　王宏升

(北華大學附屬醫院肝膽胰外科，吉林　吉林　132011)

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超氧化物歧化酶與L-精氨酸聯合預處理對大鼠肝缺血再灌注損傷的保護作用

鄧放趙不非馬躍徐巖松李鵬肖福斌王宏升

(北華大學附屬醫院肝膽胰外科，吉林吉林132011)

摘要〔〕目的觀察L-精氨酸(L-Arg)和超氧化物歧化酶(SOD)兩者分別應用和聯合應用在大鼠肝缺血再灌注損傷(I/R)中的作用及其機制。方法將大鼠隨機分為假手術組、I/R組、L-Arg預處理組(L-Arg組)、SOD預處理組(SOD組)、L-Arg和SOD聯合預處理組(L-Arg+SOD組)。治療組大鼠肝缺血前分別及聯合給予L-精氨酸和SOD ,再灌注后分別分析血液丙氨酸轉氨酶(ALT), 天冬氨酸轉氨酶(AST)水平；切取肝臟組織測一氧化氮合酶(NOS)、一氧化氮(NO)、丙二醛(MDA)含量；組織病理學觀察肝細胞各種病理變化。結果治療組ALT、AST活性較I/R組有所降低(P<0.05)， L-Arg+SOD組降低更明顯(P<0.05)。和I/R組相比較，治療組eNOS的表達、NO的量增加(P<0.05)，誘導型NOS(iNOS)表達增加不明顯，和I/R組相比較卻有所降低，MDA含量顯著降低(P<0.05)，以上各項指標在各治療組中均以L-Arg+SOD組變化更明顯(P<0.05)。I/R組示肝組織破壞明顯，治療組明顯改善。結論SOD與L-精氨酸均能夠對大鼠肝I/R損傷具有保護作用，兩者聯用效果更好。

關鍵詞〔〕一氧化氮;超氧化物歧化酶;L-精氨酸;肝缺血再灌注損傷

第一作者：鄧放(1974-)，男，博士，副主任醫師，主要從事腹腔鏡膽道外科研究。

缺血再灌注(I/R)損傷在肝臟手術特別是肝切除和肝移植手術中是比較常見的，常伴有微循環的障礙、組織壞死、細胞死亡等情況〔1〕。在這一過程中，氧化損傷起著非常關鍵的作用。超氧化物歧化酶(SOD) 作為一種氧自由基清除劑能夠減輕肝細胞I/R損傷,早已經在動物實驗和臨床實踐中得到證實并廣泛應用。近年研究表明，由I/R引起的肝細胞損傷，促發了一系列復雜的生化反應，這中間一氧化氮(NO)扮演著關鍵的角色，由其產生的三個亞型在肝臟功能中都扮演著重要的角色〔2〕。先前的研究已經證實了L-精氨酸(L-Arg,NO的前體)在NO介導路徑中的作用〔3〕。本研究評價SOD和L-精氨酸同時給藥對于I/R損傷模型鼠肝臟結構和肝功能指標的影響。

1材料和方法

1.1藥品及試劑L-精氨酸和外源性SOD購自上海普振生物科技公司；血清天冬氨酸轉氨酶(ALT)試劑盒、丙氨酸轉氨酶(AST)試劑盒、丙二醛(MDA)試劑盒、一氧化氮合酶(NOS)試劑盒、NO試劑盒購自南京建成生物工程研究所。

1.2實驗動物及分組取健康活潑的大鼠50只(由北華大學動物實驗中心提供)，雌雄不限，質量200～300 g，隨機分成5組，每組10只，術前12 h禁食，但可以飲水，分別為假手術組、I/R組、L-Arg預處理組(L-Arg組)、SOD預處理組(SOD組)、L-Arg和SOD聯合預處理組(L-Arg+SOD組)。SOD 用0.1 mol/L EDTA溶液(pH7.8)溶解，配成4 000 U/ml的溶液。缺血前予以SOD(2 000 U/100 g)及L-Arg(40 mg/100 g)腹腔內注射給藥，假手術組和I/R組腹腔內注射生理鹽水(0.5 ml/100 g)。

1.3動物模型制備稱重后按體重予烏拉坦(1.2 g/kg體重)腹腔注射麻醉，取上腹部正中切口，顯露肝門、肝蒂，分離肝動脈、門靜脈。采用Pringle氏法制備肝缺血再灌注損傷模型，用無損傷小動脈夾以0.9 N的閉合力阻斷肝十二指腸韌帶中的肝動脈、門靜脈和膽總管，造成全肝缺血；30 min后，松開動脈夾實行再灌注3 h，肉眼見肝臟由暗紅色變成鮮紅，表明再灌注成功。假手術組肝動脈和門靜脈暴露但不阻斷。

1.4取材及觀察指標在再灌注結束后，用肝素管從下腔靜脈抽取5 ml血液。血液樣本在室溫下800 r/min離心10 min，分離出血漿用作分析丙氨酸轉氨酶(ALT), 天冬氨酸轉氨(AST)水平。切取肝臟組織放入-80℃冰箱保存，作為組織病理學研究和生化分析。取適量肝組織制成10%勻漿，用BCA法測總蛋白含量，硝酸還原酶法測NO含量，MDA試劑盒測MDA含量。組織病理學觀察取肝組織塊，經固定后，脫水、浸蠟、包埋，制作4 μm切片，行HE染色，400倍電鏡視野下觀察肝細胞病理變化。

1.5統計學處理采用SPSS17.0軟件進行單因素方差分析和q檢驗。

2結果

2.1各組血清ALT、AST水平見表1。I/R組血清ALT、AST活性顯著高于假手術組，差異有統計學意義(P<0.05)，L-Arg組和SOD組ALT、AST活性較I/R組有所降低，差異有統計學意義(P<0.05)； L-Arg+SOD組血清ALT、AST活性和SOD組及L-Arg組相比較降低，差異有統計學意義(P<0.05)。

組別ALTAST假手術組30.3±12.328.6±10.3I/R組370.8±102.31)360.4±96.31)SOD組200.5±76.42)187.6±66.62)L-Arg組297.3±100.32)279.8±90.62)L-Arg+SOD組111.7±40.82)3)4)101.8±32.72)3)4)

與假手術組比較：1)P<0.05；與I/R組比較:2)P<0.05；與SOD組比較:3)P<0.05；與L-Arg組比較:4)P<0.05，下表同

2.2各組肝組織NOS，NO，MDA測定的結果I/R組內皮型NOS(eNOS)的表達及NO含量和假手術組無顯著差異，而治療組eNOS的表達及NO含量顯著增加(P<0.05)。相反，誘導型NOS(iNOS)表達I/R組較假手術組顯著增加，治療組卻增加不明顯，但和I/R組相比較卻有所降低(P<0.05)。與假手術組比較，I/R組小鼠肝組織MDA含量顯著升高(P<0.05)，和I/R組相比較治療組顯著降低(P<0.05)，以上各項指標在各治療組中均以L-Arg+SOD組變化更明顯(P<0.05)。見表2。

2.3各組肝臟病理組織學結果假手術組有正常的肝組織結構：肝索排列整齊，肝竇形態基本正常，無狹窄及擴張，肝細胞邊界清楚、形態無異常變化。I/R組示肝組織肝索排列明顯紊亂，肝竇形態不規則，竇狀隙充血，部分內皮細胞脫落，有少量中性粒細胞浸潤。各治療組肝細胞結構完整，肝細胞水腫較少，肝索排列可，肝竇形態較規則，僅有少量中性粒細胞浸潤及局灶的竇狀隙充血(見圖1)。

表2各組肝組織NOS、NO、MDA含量比較

組別eNOS(U/mgprot)iNOS(U/mgprot)NO(μmol/mgprot)MDA(nmol/mgprot)假手術組0.46±0.110.26±0.090.36±0.153.83±1.54I/R組0.51±0.150.51±0.221)0.41±0.1515.42±6.381)SOD組0.61±0.222)0.30±0.122)0.81±0.222)10.65±4.612)L-Arg組0.63±0.202)0.33±0.202)0.93±0.202)10.85±3.652)L-Arg+SOD組0.81±0.292)3)4)0.20±0.292)3)4)1.21±0.292)3)4)5.87±2.712)3)4)

圖1　各組肝組織病理改變(HE，×400)

3討論

肝臟移植、肝部分切除手術、處理嚴重的肝臟外傷時，都需要暫時性阻斷肝血流，重新恢復血液供應后，可造成肝的缺血再灌注損傷。再灌注損傷是致手術后肝臟功能衰竭的重要原因之一。其病理生理過程復雜，迄今尚無明確認識，故對其發生機制的研究已成為醫學界關注的熱點，如何減輕肝I/R損傷亦是目前肝臟外科特別是肝移植外科的研究熱點之一〔4〕。

氧化應激損傷在包括器官移植在內的I/R損傷中扮演重要的作用。缺血導致肝細胞出現快速的生化、結構的改變，進而引起肝細胞功能變化。I/R損傷在主要器官促發一系列反應。這些反應通過細胞因子和炎性介質的釋放引出一系統炎癥反應(腫瘤壞死因子-α，白細胞介素6，血小板活性因子，白三烯和NO)并引起隨后的氧化應激〔5，6〕。

在這方面，幾個研究已經說明I/R損傷是和蛋白質氧化修飾、線粒體損傷、脂質過氧化作用有著密切聯系的。這種變化是一種自動催化機制，它導致了細胞膜的破壞損傷。進而導致毒素的產生、活性代謝產物和細胞的死亡。目前沒有方法用于治療肝臟的I/R損傷，只有通過預防才能夠減少或消除損傷的發生。

脂質過氧化，作為一個獨立的損害因素，已經被認為和I/R損傷密切相關，MDA水平可以代表脂質過氧化率的一個很好的指標。和先前的結果相一致，我們的研究結果證實肝臟組織中的MDA水平在I/R后顯著增加。我們的結果也證實L-Arg和SOD可引起MDA水平的顯著降低，這些藥物可以引起保護性的反應，并起到部分凈化劑的作用〔7〕。

在肝臟I/R損傷中，肝實質損傷之前微循環紊亂是一個重要的因素。血管收縮物質和血管舒張因子的不平衡導致了早期微循環的紊亂，NO、內皮素 (ET)等起著重要作用。NO合酶(NOS)在體內有3種異構體:神經型(nNOS)、內皮細胞型(eNOS)和誘生型(iNOS)，iNOS 存在于激活的巨噬細胞和各型細胞，為非鈣和鈣調素依賴性的，生成的NO具有細胞毒作用，參與介導免疫反應〔8〕。最新的證據表明iNOS是很多的細胞因子如腫瘤壞死因子α的促發因素，它產生大量的NO，在肝臟的病理生理學中還存有很多的爭議〔9〕。由eNOS產生的適度水平的NO有較好的血管擴張的活性，而由iNOS產生的高水平的NO與超氧陰離子相互作用能夠產生過氧亞硝酸鹽陰離子，是導致肝臟氧化病理條件的潛在氧化物質。此外，由iNOS產生的NO能夠誘導白細胞黏附、炎性細胞滲入和實質細胞功能障礙。iNOS的過表達和多種慢性疾病有關。

在我們的研究中，我們觀測到iNOS表達I/R組較假手術組有顯著的增加，而治療組能夠減弱這種增加。在eNOS I/R組較假手術組沒有顯著的不同，而治療組和I/R組相比確有顯著的增加。以上變化均以L-Arg+SOD組最為顯著。本研究還發現在肝I/R損傷模型中，肝組織中的NO含量比假手術組略升高，可能為代償結果，而應用L-Arg和SOD干預后，肝組織NO含量比I/R對照組明顯增高。eNOS與NO變化具有一致性。通過eNOS活性上調、iNOS活性降低、MDA含量減少，可推測L-Arg和SOD聯合應用可能一方面通過適度影響血管內皮細胞的功能，舒張血管改善微循環; 另一方面抑制局部炎癥反應，減輕氧自由基的損傷作用。

谷胱甘肽在氧化損傷中通過參與細胞防御系統對抗氧化損傷提供主要的保護作用。研究顯示各種刺激誘導的組織損傷和谷胱甘肽的缺乏有關，高水平的谷胱甘肽水平是減少氧化損傷起到很大的作用〔10〕。但是，在I/R損傷過程中的谷胱甘肽水平的減少是由于在氧化應激中的大量消耗。血漿中肝臟大量酶的釋放也證實了再灌注伴隨著酶釋放的組織損傷。然而，在I/R損傷之后，血漿中的AST和ALT水平通過治療顯著減少，說明兩種藥物的聯合應用具有較好的減少損傷的作用。另外兩種藥物的保護性作用通過組織學發現被證實，治療后的肝葉組織保持著原有的肝臟結構，只有局部的充血和點狀壞死。

綜上所述，使用L-Arg和SOD干預后，I/R大鼠肝臟損傷減輕，可能是通過改善肝臟I/R后的微循環紊亂，減輕氧自由基對細胞的損傷所致。可以建議L-Arg和SOD能夠成為潛在的治療成分來對抗I/R誘導的氧化損傷。

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〔2015-09-17修回〕

(編輯曹夢園)

通訊作者：王宏升(1966-)，男，博士，主任醫師，碩士生導師，主要從事肝膽系統腫瘤研究。

基金項目：吉林市科學技術局基金項目(No.201233125)

中圖分類號〔〕R654. 1〔

文獻標識碼〕A〔

文章編號〕1005-9202(2015)23-6710-03；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2015.23.028