針刺耳穴對血管性癡呆大鼠學習記憶及海馬膽堿乙酰轉移酶表達的影響

楊　瓊　戴桃李　潘　婭　陳　粲

(貴州民族大學化學與環境科學學院藥學教研室，貴州　貴陽　550025)

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針刺耳穴對血管性癡呆大鼠學習記憶及海馬膽堿乙酰轉移酶表達的影響

楊瓊戴桃李1潘婭2陳粲2

(貴州民族大學化學與環境科學學院藥學教研室，貴州貴陽550025)

摘要〔〕目的探討針刺耳穴治療血管性癡呆(VD)大鼠的機制。方法四血管阻斷法建立VD大鼠模型，造模后針刺“腎”、“心”耳穴治療，用Morris水迷宮檢測大鼠空間記憶能力，免疫組織化學法檢測其海馬膽堿乙酰轉移酶(ChAT)免疫反應陽性細胞表達。結果針刺耳穴后，VD大鼠學習記憶能力明顯提高(P<0.01，P<0.05)，海馬ChAT免疫反應陽性神經元明顯增多(P<0.05)。結論針刺“腎”、“心”耳穴可改善VD大鼠學習記憶功能，可能與其促進ChAT在腦的表達、保護膽堿能神經元有關。

關鍵詞〔〕血管性癡呆(VD)；針刺；耳穴；學習記憶；膽堿乙酰轉移酶

1暨南大學醫藥生物技術研究開發中心

2貴州醫科大學基礎醫學院生理學教研室

第一作者：楊瓊(1980-)，女，碩士，講師，主要從事神經生理學研究。

血管性癡呆(VD)是由于缺血或出血性腦血管病及全腦缺血、缺氧引起的認知障礙，以學習記憶功能缺損為主，可伴有語言、運動、視空間技能及人格障礙等表現〔1〕。在我國，VD是老年期癡呆中最常見的類型之一，也是目前可預防和有希望治療的一種癡呆，但目前尚缺乏特效的VD治療方法〔2〕。中醫療法具有操作簡單、無毒副作用、標本兼治的優勢〔3,4〕。本研究在制備VD大鼠模型的基礎上，采用針刺“心”、“腎”耳穴的方法進行治療，然后檢測VD大鼠學習記憶能力，并測定海馬齒狀回處膽堿乙酰轉移酶(ChAT)的水平，以探討此方法的有效性及其可能機制。

1材料與方法

1.1 動物及試劑5～6月齡健康雄性SD大鼠45只，體重280～300 g，清潔級，由貴陽醫學院動物中心提供。ChAT檢測試劑盒由武漢博士德生物工程有限公司提供。

1.2 方法

1.2.1 動物模型制備和治療方法大鼠隨機分為對照組、模型組和針刺組，每組15只。采用改良Pulsinelli四血管阻斷(4-VO) 法建立VD大鼠模型。模型組和針刺組麻醉后行背側頸正中切口，用電凝針燒灼雙側第一頸椎橫突翼小孔內的椎動脈，造成永久性閉塞；再行腹側頸正中切口，分離雙側頸總動脈，24 h后用微動脈夾夾閉雙側頸總動脈，5 min×3次，每次間隔1 h。對照組處理步驟同上，但不進行椎動脈燒灼和頸總動脈夾閉。針刺組在造模后，參照圖譜定位，自制耳針刺激于“腎”、“心”耳穴，持續4 w。

1.2.2 行為學測試實驗第4周進行Morris水迷宮實驗。迷宮分為4個象限，在第Ⅲ象限置一個站臺，沒于水下2 cm。第1～6天行定向航行試驗：將大鼠按Ⅰ～Ⅳ的順序依次放入水中，記錄大鼠60 s內從入水到爬上站臺所需時間，即逃避潛伏期。第7天行空間探索試驗：拆去站臺，記錄120 s內大鼠在原站臺所在象限(Ⅲ象限)的游泳時間和穿越站臺位置的次數。

1.2.3 免疫組化染色水迷宮實驗后麻醉大鼠，自左心室插管灌注生理鹽水和10%中性甲醛以固定鼠腦，經脫水、透明、石蠟包埋處理后，行鼠腦海馬冠狀位切片，片厚4～5 μm，每只大鼠切5張片。免疫組織化學SABC法檢測海馬齒狀回ChAT的表達，操作嚴格按照說明書進行。每張切片取5個視野，每個視野采集一幅圖像，計數ChAT免疫反應陽性細胞數及測定平價光密度值，取其平均值作為最后結果。

1.3 統計學方法應用SPSS13.0軟件行單因素方差分析及S-N-K檢驗。

2結果

2.1 行為學測試定向航行試驗中逃避潛伏期模型組大鼠較對照組大鼠明顯延長(P<0.05)，而針刺組較模型組明顯改善(P<0.05)。見表1。空間探索試驗中大鼠穿越站臺次數和第Ⅲ象限活動時間為：對照組(5.75±1.86)次和(49.27±6.53)s，模型組(1.00±0.64)次和(25.35±5.70)s，針刺組(3.35±1.20)次和(36.68±5.77) s；模型組與對照組比較(P<0.01)及針刺組與模型組比較(P<0.05)差異顯著。

2.2 海馬齒狀回ChAT的表達 對照組大鼠海馬齒狀回顆粒細胞數目多、排列緊密，其中有大量ChAT陽性神經細胞分布，且胞質內有大量棕黃色陽性物質；細胞結構清楚，胞體較大呈圓形或橢圓形，有的可見神經元突起。模型組海馬齒狀回細胞嚴重脫失，細胞結構模糊，胞體固縮，染色較淡，ChAT陽性神經細胞數較對照組明顯減少 (P<0.01)。針刺組陽性神經細胞數量較模型組增加(P<0.05)，細胞結構形態接近對照組。見圖1和表2。

組別第1天第2天第3天第4天第5天第6天對照組43.54±6.2127.85±8.9024.76±6.1418.91±5.1513.40±5.5612.10±4.50模型組54.72±7.411)52.78±7.452)43.29±4.912)39.47±4.752)34.93±3.742)33.77±10.482)針刺組49.18±7.0735.76±4.594)31.81±5.993)28.06±5.414)25.53±3.674)22.36±8.554)

與對照組比較：1)P< 0.05, 2)P<0.01；與模型組比較：3)P<0.05, 4)P<0.01

圖1　各組大鼠海馬齒狀回ChAT陽性神經細胞(SABC,×400)

組別細胞計數(個/視野)平均光密度值對照組62.21±6.1984.56±7.61模型組30.62±3.261)170.06±11.931)針刺組40.03±2.762)149.61±3.762)

與對照組比較：1)P<0.01；與模型組比較：2)P<0.05

3討論

腦反復缺血再灌注損傷和長期慢性低灌流是VD的主要發病原因〔1〕。本實驗采用國際公認的改良Pulsinelli 4-VO法，可逆性阻斷頸總動脈血流并永久性灼斷椎動脈，使大鼠腦處于長期低灌流狀態，致腦功能嚴重受損，制備出近似人類臨床發病特點的VD大鼠模型〔5〕。海馬結構是參與學習和記憶功能的重要腦區，也是大腦極具可塑性但極易受損的一個腦區，對缺血缺氧極為敏感。美國心理學家Deutsch早在70年代初就提出“記憶膽堿能突觸假說”：記憶突觸就是膽堿能突觸，是學習記憶的結構和生理基礎〔6〕。海馬內富含膽堿能神經纖維投射，當膽堿能神經元受損時，腦內學習記憶的神經生物學基礎——海馬環路就會受損，導致癡呆發生。乙酰膽堿作為神經遞質存在于膽堿能神經元內，是迄今發現與學習記憶關系極為密切的一種神經遞質〔7〕。 ChAT是細胞內催化乙酰膽堿合成的關鍵酶，與乙酰膽堿的分布幾乎平行，常作為研究膽堿能神經元的標志或評估乙酰膽堿含量的間接指標〔8〕。本實驗采用陽性細胞計數和平均光密度值兩個指標來評價ChAT在海馬齒狀回的表達，其中平均光密度值代表的是陽性表達部位的透光程度，其值大小與目標物表達水平呈反比的關系。中醫將VD歸屬于“中風”、“呆病”、“善忘”的范疇，認為腎虛髓空為本，血瘀痰濁為標〔4〕。祖國醫學很早就認為，耳具有全身五臟六腑和肢體的縮影，帶有整體信息。《證治準繩》中有“腎為耳竅之主，心為耳竅之容”。刺激耳穴“腎”具有益精血、補腦髓、暢活氣血、固本培元之功；刺激耳穴“心”具有主血調神，疏通經脈、活血止痛之功；加之針灸治療VD有多方面優勢：降低血液黏度、促進側支循環建立、改善腦缺血缺氧等作用〔3，9〕。本文結果表明針刺“腎”、“心”耳穴可改善VD大鼠學習記憶功能，可能與其促進ChAT在腦的表達、保護膽堿能神經元有關。

參考文獻4

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7Berger-Sweeney J. The cholinergic basal forebrain system during development and its influence on cognitive processes: important questions and potential answers〔J〕.Neurosci Biobehav Rev,2003;27(4):401-11.

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9曲姍姍,盧陽佳,黃泳,等.針灸治療血管性癡呆的機制研究〔J〕.上海針灸雜志,2010;29(12):805-8.

〔2014-01-11修回〕

(編輯趙慧玲/曹夢園)

中圖分類號〔〕R338.64〔

文獻標識碼〕A〔

文章編號〕1005-9202(2015)23-6712-03；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2015.23.029