中藥組方對人外周血造血干細胞的影響

許淑芬　王英凱　馬寅芙　張天旭　金哲明　孫牧男　劉　磊　譚　巖

(吉林省人民醫院中心實驗室，吉林　長春　130021)

?

中藥組方對人外周血造血干細胞的影響

許淑芬王英凱1馬寅芙張天旭金哲明孫牧男劉磊譚巖

(吉林省人民醫院中心實驗室，吉林長春130021)

摘要〔〕目的探討中藥組方對健康供者外周血造血干細胞的影響。方法34例志愿健康供者應用中藥組方，1次/d，1袋/次，服用1個月。采用血細胞計數儀檢測外周血中單個核細胞數，流式細胞儀檢測CD34+細胞數的變化；通過RT-PCR法觀察服藥前后外周血造血細胞生長因子白細胞介素(IL)-3、粒細胞集落刺激因子(GM-CSF)的mRNA半定量表達情況。結果與服藥前相比，外周血單核細胞、CD34+細胞數明顯增高(P<0.01)，服藥后IL-3、GM-CSF mRNA的半定量表達水平與服藥前相比差異顯著(P<0.01)。結論中藥組方可能通過增強造血生長因子IL-3、GM-CSF mRNA表達水平,刺激造血細胞分化成熟，有效動員外周血造血干細胞，供者無明顯的不良反應。

關鍵詞〔〕造血干細胞;CD34+抗原；造血細胞因子；中草藥

1吉林大學第一醫院胃腸內科

第一作者：許淑芬(1962-)，女，主任技師，主要從事免疫與分子生物學技術研究。

外周血造血干細胞移植和骨髓移植相比，具有采集方便、安全、移植后重建造血迅速的特點。但在正常情況下，外周血中干細胞數量很少，難以達到足夠數量以保證臨床需要。許多學者〔1，2〕發現許多中草藥可以作用于不同時期的造血干細胞，并從蛋白質和分子水平影響參與造血干細胞的增殖分化，達到重建骨髓造血功能的目的〔3〕。本研究旨在探討中草藥對人外周血造血干細胞的作用和影響。

1材料與方法

1.1主要試劑Trizol試劑(Invitrogen公司)；AMV 逆轉錄酶、Oligo(dT)15p引物、RNA酶抑制劑(Promega公司)；Taq DNA聚合酶(Takara公司)。抗人CD34-PE、CD45-FITC(BD公司)。

1.2對象我院中醫科2012年12月至2014年6月正常體檢供者34例，中位年齡55歲(30～80歲)，中位身高166 cm(137～180 cm)，中位體重65 kg(43～100 kg)，男18例，女16例。

1.3給藥方法總結了幾十年行醫經驗，經臨床使用并反復調整后，形成了一組48味中藥組成的固定組方藥。稱取一定量的藥物，根據藥物特性分別加適量冷水浸泡40 min，大火燒開后，文火繼續熬1 h，最后定容體積為80 ml，裝袋封口。受試者1次/d，1袋/次。服用1個月。

1.4外周血單核細胞數檢測分別于服藥第0(服藥前)、10、30 d采集外周血10 ml，1∶1加入生理鹽水稀釋，輕輕加于淋巴細胞分離液表面，1 700 r/min離心20 min，收集單核細胞，加入磷酸鹽緩沖液(PBS)洗2次，用吸管反復輕柔吹打制成單細胞懸液，采用細胞計數儀常規計數。

1.5外周血CD34+細胞數檢測取1.4制備好的單核細胞懸液，將細胞濃度調至1×106/ml，取細胞懸液100 μl，加入CD34-PE、CD45-FITC單抗，振蕩幾秒后，避光孵育30 min，PBS緩沖液洗滌2次，1 000 r/min離心10 min，棄上清，加0.5 ml PBS上流式細胞儀檢測分析。

1.6白細胞介素(IL)-3、粒細胞集落刺激因子(GM-CSF)引物的設計與合成按照引物的設計原則，從GenBank獲取IL-3、GM-CSF、β-actin人全長cDNA序列，引物序列為IL-3：正義5′- GCTCCCATGACCCAGACAACGTCC-3′，反義5′- CAGATAGAA CGTCAGTTTCCTCCG-3′，片段長度345 bp;GM-CSF：正義5′- CTGCTGAGATGAATGAAACAG -3′，反義5′- AGTGCTGCTTGTAGTGGCT -3′，片段長度165 bp;內參β-actin：正義5′-TGACGGGGTCACCCACACTGTGCC-3′，反義5′-CTAGAAGCATTTGCGGTGGACGATGGA-3′，片段長度662 bp。以上序列由賽百盛公司合成。

1.7RT-PCR檢測IL-3、GM-CSF、β-actin mRNA表達取制備的單核細胞，使用Trizol試劑盒提取細胞總RNA，參照產品說明操作，使用逆轉錄試劑盒將mRNA逆轉錄為cDNA，選擇β-actin作為內參照。PCR循環參數為：95℃預變性5 min，然后95℃ 45 s、55℃ 45 s、72℃ 45 s。30個循環后再72℃延伸10 min。產物經1.5%瓊脂糖凝膠電泳。

1.8統計學方法使用SPSS11.5軟件進行t檢驗。

2結果

2.1服藥前、后單核細胞計數結果服藥前單核細胞檢測數量無顯著差異(P>0.05)，服藥后第10、30天〔(37.55±10.96)×109/L,(39.17±12.71)×109/L〕與第0天〔(6.75±1.76)×109/L〕比較顯著增高(P<0.01)，并以第10天增高最為明顯；但第30天與第10天比較差異不顯著(P>0.05)。

2.2服藥前、后CD34+抗原檢測服藥后第10、30天〔(0.24±0.05)%、(0.45±0.11)%〕與第0天〔(0.01±0.004)%〕比較CD34+細胞數量顯著增高(P<0.01)，服藥第30天與第10天比較也有顯著增高(P<0.05)。

2.3RT-PCR檢測IL-3、GM-CSF、β-actin mRNA表達見圖1。服藥前IL-3、GM-CSF mRNA表達水平低下，經服用該組方藥治療后，第10、30天的IL-3、GM-CSF mRNA表達水平明顯提高，并以第30天最高。

1：第0天；2：第10天；3：第30天；4：DNA Ladder圖1　RT-PCR檢測IL-3、GM-CSF mRNA表達

3討論

造血干細胞是存在于造血組織、能夠進行自我更新和定向分化成各種血細胞，具體的造血分子調控機制尚不清楚，研究發現，許多中藥可直接或間接影響造血干細胞的生物學特性，實現對造血系統的正向調節作用。黃芪、當歸等可促進造血干細胞的分化增殖，促進GM-CSF等內源性因子的分泌〔4，5〕。芍藥苷可促進骨髓間充質干細胞分泌造血因子，抑制造血抑制因子的分泌，促進血液生成〔6〕。丹參具有活血化瘀功效，可刺激基質細胞分泌細胞因子，修復微環境，促進細胞的增殖、分化并向外周血遷移〔7〕。 IL-3、GM-CSF是多克隆集落刺激因子，是造血干細胞增殖分化的調節因子，通過與靶細胞表面的受體結合傳遞生長、分化信號，調控造血干細胞生存并向各系血細胞分化成熟〔8，9〕。

本研究說明該組方藥能夠刺激人IL-3、GM-CSF的表達，并相互協同作用，從多途徑、促進造血干細胞的增殖與分化。為進一步開發出臨床應用促進骨髓造血功能并減輕副作用提供了新的方法。

參考文獻4

1嚴善福，陶箭，葉裕春.牛膝多糖促進骨髓細胞粒細胞集落形成〔J〕.上海第二醫科大學學報，2003；23(1)：38-40.

2劉文勵，孫慢英，周劍鋒.復方活血湯對放射性損傷小鼠造血細胞bcl-2、bax、bcl-XL基因表達的作用〔J〕.中華放射醫學與防護雜志，1998；18(2)：256-8.

3王茜，楊旭輝，高月，等.補腎解毒活血法與益氣補血法對骨髓抑制小鼠造血功能影響的比較研究〔J〕.中國實驗方劑學雜志，2012；18(1)：192-5.

4劉曉，武正炎，范萍.黃芪與粒細胞-集落刺激因子對外周血干細胞移植術后早期造血功能重建影響的觀察〔J〕.南京醫科大學學報，2000；20(4)：281-4.

5胡晶，吳宏.當歸多糖對小鼠外周血造血干細胞動員作用的研究〔J〕.中草藥，2006；37(12)：1835-8.

6高月，馬增春，譚洪玲，等.四物湯及其提取物對輻射致血虛證小鼠造血作用的研究〔J〕.天津中醫藥，2003；20(6)：47.

7葉鐵真，吳梓粱.丹參注射液對家兔粒-巨噬系細胞動員作用的研究〔J〕.實驗血液學雜志，1995；3(1)：68-73.

8Liu MX，Tan HN，Zhang XK.Hematopoietic effects and mechanisms of Fufang e jiao jiang on radiotherapy and chemotherapy-induced myelosuppressed mice〔J〕. J Ethnopharmacol，2014；152(3)：578-84.

9Lee JG，Hsieh WT，Chen S. Hematopoietic and myeloprotective activities of an acidic Angelica sinensis polysaccharide on human CD34+ stem cells〔J〕. J Ethnopharmacol，2012；139(3)：739-45.

〔2015-09-10修回〕

(編輯曲莉/滕欣航)

通訊作者：譚巖(1956-)，男，醫學博士，博士生導師，主要從事腫瘤生物治療的臨床及科研研究。

基金項目：吉林省衛生廳資助課題項目(2012Z088)

中圖分類號〔〕R34〔

文獻標識碼〕A〔

文章編號〕1005-9202(2015)23-6714-02；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2015.23.030