α7nAchR 713T>C突變對阿爾茨海默病小鼠認知功能和tau蛋白磷酸化的影響

鄧　娟　王延江　劉　娟　易　旭　曾　凡　劉雨輝　姚秀卿　曹洪元　嚴家川　周華東　許志強

(第三軍醫大學大坪醫院野戰外科研究所神經內科，重慶　400042)

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α7nAchR 713T>C突變對阿爾茨海默病小鼠認知功能和tau蛋白磷酸化的影響

鄧娟王延江劉娟易旭曾凡劉雨輝姚秀卿曹洪元嚴家川周華東許志強

(第三軍醫大學大坪醫院野戰外科研究所神經內科，重慶400042)

摘要〔〕目的研究α7nAchR 713T>C突變對阿爾茨海默病(AD)小鼠認知功能和tau蛋白磷酸化的影響。方法3月齡敲除α7nAchR基因的APPSwe小鼠(APPa7KO小鼠)20只，隨機分為2組，每組10只，分別在AD小鼠海馬注射突變型和野生型7nAchR cDNA，注射后采用Morris水迷宮檢測APPa7KO小鼠認知功能的變化，免疫組化方法檢測AD小鼠tau(Thr231)表達。結果與注射野生型7nAchR cDNA小鼠相比，注射突變型7nAchR cDNA小鼠的逃避潛伏期和游泳距離延長，小鼠海馬tau(Thr231)陽性細胞數顯著增多(P<0.01)。結論α7nAchR 713T>C突變加重了AD小鼠的認知功能損害和tau蛋白磷酸化。

關鍵詞〔〕α7nAchR；阿爾茨海默病；tau蛋白

第一作者：鄧娟(1976-)，女，副主任醫師，副教授，博士，碩士生導師，主要從事老年性癡呆發生機制與防治研究。

阿爾茨海默病(AD)是影響老年人健康的一個重要疾病，揭示AD發病機制、尋找有效防治方法是急需解決的重要科學問題〔1〕。研究表明，吸煙增加了AD發生的危險性和病情嚴重程度，但具體機制尚不清楚〔2～4〕。尼古丁是香煙中的主要致病物質，7煙堿型乙酰膽堿受體(7nAChR)介導了尼古丁的神經毒性作用〔5〕。前期研究表明，在漢族老年人群中吸煙使AD發生的危險性提高2.72倍。在吸煙患AD的人群中7nAChR基因第7外顯子Leu238Pro(713T>C)突變頻率明顯高于吸煙未患AD的人群〔6〕，提示7nAChR基因該位點突變可能參與了吸煙人群AD的發生過程。本研究探討7nAChR 713T>C突變對AD認知功能和tau蛋白磷酸化的影響。

1材料與方法

1.1材料與試劑3月齡APPa7KO小鼠20只，均源于美國Jackson實驗室。tau(Thr231)，tau(pT181) 和 tau(ps202)抗體購自美國Cell Signal公司，突變型AAV-7nAchR cDNA，野生型AAV-7nAchR cDNA自行構建。

1.2方法

1.2.1實驗動物分組APPa7KO小鼠20只，隨機分為突變型和野生型，每組10只，分別在小鼠海馬注射突變型7nAchR cDNA和野生型7nAchR cDNA。

1.2.2海馬注射采用吸入麻醉機下 Halothane 麻醉小鼠，將小鼠固定于立體注射儀上。頭頂剃毛消毒后，切開頭頂皮膚，暴露顱骨。海馬注射定位：在左側囟門后2.3 mm，中線外側1.8 mm處鉆孔。采用Hamilton微量注射器，從鉆孔出垂直進針2.0 mm。以0.5 μl/min的速度于左側注入2 μg突變型AAV-7nAchR cDNA或野生型AAV-7nAchR cDNA，注射完畢后留針2 min，以0.5 mm/30 s的速度退針。

1.2.3AD小鼠行為學檢測Morris水迷宮進行行為學檢測。水池分為4個象限，分別稱SW、NW、SE、NE象限，在NE象限正中放置一直徑6 cm的平臺，平臺頂低于水面0.5 cm。實驗室內光線良好，水溫維持在(25±0.5)℃，攝像機安置于水池上方2.5 m處，并與安裝有示蹤軟件的計算機相連。①定位航行實驗：實驗前1 d下午將小鼠放入水中自由游泳2 min，使其熟悉實驗環境。實驗歷時4 d，每天上、下午2個時間段，每個時間段訓練4次。每次訓練隨機選擇一個入水點將小鼠面向池壁放入水池，記錄小鼠找到平臺的時間，即逃逸潛伏期。至90 s找不到平臺，即將其引上平臺，潛伏期記為90 s。每一時間段內4次潛伏期的算術平均值作為這一時間段的學習成績；②空間探索實驗：訓練第4天平臺實驗結束后，小鼠在籠中停留2 h。然后撤除平臺，進行空間探索實驗。將小鼠放至池中，記錄實驗小鼠在40 s內穿越平臺所在象限的次數，計算小鼠在平臺所在象限的游泳時間占總時間的百分比。

1.2.4免疫組化染色行為學檢測完畢后后次日殺死動物并灌注、取材，行冠狀冰凍切片，片厚25 μm，每隔6張取1張切片，取其中1套(約10張含海馬結構)進行免疫組化染色并計數，累加后乘6即為一側海馬tau(Thr231)陽性細胞數。新鮮配置3%H2O2，室溫浸泡5～10 min以滅活內源性酶；PBS洗滌10 min×3次，加封閉用血清，室溫30 min。滴加tau(Thr231)一抗(1∶500)，恒溫下(4℃)孵育24 h；PBS沖洗10 min×3次，加入封閉緩沖液配制的二抗為抗兔IgG生物素標記二抗溶液(1∶500)，室溫孵育2 h。PBS沖洗10 min×3次，加入ABC(1∶200)，室溫孵育1 h。DAB顯色，鏡下觀察并及時終止顯色。梯度酒精脫水，二甲苯透明，封片陰干后鏡下觀察。

2結果

2.1Morris水迷宮實驗兩組小鼠找到平臺的時間隨著訓練天數縮短，突變型7nAchR AD小鼠在每個時間段平均逃避潛伏期大于野生型7nAchR AD小鼠(P<0.05)。見表1。兩組小鼠游泳速度隨著訓練天數增加而減慢，但兩組間的游泳速度無明顯統計學差異(P>0.05)。見表2。空間探索試驗中，兩組小鼠多圍繞池壁游泳或跨直徑游泳。突變型7nAchR AD小鼠初次找到平臺的時間〔(16.39±6.52)s〕多于野生型7nAchR AD小鼠〔(11.28±5.74)s〕，跨越平臺的次數〔(2.20±1.00)次〕少于野生型7nAchR AD小鼠〔(4.20±0.8)次，P<0.05〕。

組別1d2d3d4d突變型29.25±6.971)21.58±3.671)17.63±3.251)14.41±2.131)野生型24.13±4.5516.76±3.1913.41±2.5610.35±1.34

與野生型比較：1)P<0.05

組別1d2d3d4d突變型15.92±0.9711.47±0.5910.53±0.549.48±0.47野生型15.23±0.9111.62±0.6210.69±0.4810.03±0.42

2.2AD小鼠tau(Thr231)的表達突變型7nAchR AD小鼠海馬平均tau(Thr231)陽性細胞數(236.35±34.68)與野生型AD小鼠(128.62±16.35)比較明顯增多(P<0.01)。見圖1。

圖1　免疫組化檢測AD小鼠海馬tau(Thr231)陽性細胞(DAB，×200)

3討論

tau蛋白異常磷酸化是AD的重要特征，研究發現α7nAChR與tau蛋白異常磷酸化存在密切關系，在AD的發病機制中具有重要作用〔7，8〕。α7nAchR同時也介導了tau蛋白異常磷酸化，尼古丁與α7nAchR結合后，通過p38途徑引起tau蛋白在ser202、thr181、thr231等位點的異常磷酸化〔9，10〕。α7nAChR在促進tau蛋白磷酸化中發揮重要的作用。

為闡明α7nAchR Leu238Pro(713T>C)突變在AD發生中的作用，本研究克隆了此含有該突變的突變型人α7nAchR基因和野生型人α7nAchR基因。以腺相關病毒為載體，在α7nAchR基因敲除的APPSwe小鼠腦內轉染突變型和野生型人α7nAchR基因，檢測α7nAchR713T>C突變對AD小鼠的影響，結果顯示α7nAchR 713T>C突變加重了AD小鼠的認知功能損害和tau蛋白磷酸化。

α7nAchR M1-M2區是決定受體功能的關鍵位點〔11，12〕，我們發現的α7nAChR 713T>C突變恰好位于該區域。該區域的氨基酸序列非常保守，此突變可能對受體的表達和功能產生重要影響〔13，14〕。α7nAchR Leu238Pro(713T>C)的突變加重了AD小鼠的認知功能損害和tau蛋白異常磷酸化，可能與α7nAchR 713T>C突變影響7nAChR與配體的結合能力有關。7nAChR與尼古丁結合后能抑制Aβ的神經毒性作用而發揮神經保護作用，7nAChR M1-M2區是決定受體功能的關鍵位點。該突變可能影響7nAChR與配體的結合能力，或由于突變導致受體空間構象改變影響離子通道開放，從而使其喪失神經保護作用。腦內tau蛋白異常磷酸化是AD的重要特征。而7nAChR的選擇性配體或激動劑可抑制tau蛋白磷酸化。推測7nAchR發生713T>C突變后，可能失去其抑制功能，而導致tau蛋白異常磷酸化加劇。

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〔2014-06-05修回〕

(編輯安冉冉/曹夢園)

通訊作者：許志強(1969-)，男，博士，教授，碩士生導師，主要從事老年性癡呆的研究。

基金項目：第三軍醫大學青年人才創新基金(No.2010XQN31)

中圖分類號〔〕R749〔

文獻標識碼〕A〔

文章編號〕1005-9202(2015)23-6716-03；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2015.23.031