丹參對單側(cè)輸尿管結(jié)扎模型大鼠腎臟核因子-κB及氧化物酶體增殖物激活受體-γ表達(dá)的影響

鐘　丹　鄒亦平　延衛(wèi)東　黃宇清　陳小麗　王　娟

(井岡山大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院，江西　吉安　343009)

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丹參對單側(cè)輸尿管結(jié)扎模型大鼠腎臟核因子-κB及氧化物酶體增殖物激活受體-γ表達(dá)的影響

鐘丹鄒亦平1延衛(wèi)東黃宇清陳小麗1王娟

(井岡山大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院，江西吉安343009)

摘要〔〕目的探討丹參對單側(cè)輸尿管結(jié)扎(UUO)所致腎間質(zhì)纖維的影響及可能機(jī)制。方法應(yīng)用UUO建立腎間質(zhì)纖維化大鼠模型，丹參干預(yù)組按劑量高低分為低劑量組，中劑量組，高劑量組，各組均從模型建立前48 h開始灌胃，于造模后第7天，留取梗阻側(cè)腎臟行HE、Masson染色，觀察腎組織病理結(jié)構(gòu)變化，采用免疫組化方法檢測腎組織核因子(NF)-κB及氧化物酶體增殖物激活受體(PPAR)-γ的表達(dá)，RT-PCR方法檢測NF-κB及PPAR-γ mRNA的表達(dá)。結(jié)果UUO模型組大鼠腎組織可見腎小管上皮細(xì)胞變性、間質(zhì)炎性細(xì)胞浸潤、纖維組織增生等病理變化，丹參各劑量組與UUO模型組大鼠相比較均有不同程度的改善，其中以丹參高劑量組改善最為明顯。與空白組相比較，UUO 模型組中NF-κB表達(dá)明顯增高，PPAR-γ表達(dá)明顯降低。丹參高、中劑量組NF-κB表達(dá)水平明顯低于UUO 模型組，丹參高劑量組PPAR-γ表達(dá)增強(qiáng)，與UUO模型組相比較有顯著差異。結(jié)論丹參可通過抑制NF-κB的表達(dá)，增強(qiáng)PPAR-γ的表達(dá)，從而起到腎臟保護(hù)和抗腎間質(zhì)纖維化的作用。

關(guān)鍵詞〔〕丹參；腎間質(zhì)纖維化；核因子-κB；氧化物酶體增殖物激活受體-γ

1井岡山大學(xué)附屬醫(yī)院

第一作者：鐘丹(1974-)，男，副教授，副主任醫(yī)師，博士，主要從事腎臟疾病的臨床、教學(xué)和科研工作。

腎間質(zhì)纖維化是各種慢性腎臟疾病發(fā)展至終末期腎衰竭的共同機(jī)制，傳統(tǒng)中醫(yī)理論認(rèn)為瘀血是腎臟疾病發(fā)生發(fā)展過程中重要的病理因素，活血化瘀在慢性腎臟疾病的治療中占有重要地位。丹參在心腦血管系統(tǒng)及腎臟疾病中作用顯著。本研究觀察丹參對單側(cè)輸尿管結(jié)扎(UUO)大鼠模型腎組織核因子(NF)-κB及氧化物酶體增殖物激活受體(PPAR)-γ表達(dá)的影響，以進(jìn)一步闡明該藥抗腎間質(zhì)纖維化的可能作用機(jī)制。

1材料與方法

1.1材料健康SD雄性大鼠，體質(zhì)量(200±10)g，清潔級，由廣州中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供，合格證號：0003467。飼以標(biāo)準(zhǔn)大鼠合成飼料，自由飲用大鼠專用無菌水。丹參水煎液由本課題組成員自行制備。吡格列酮購自杭州中美華東制藥有限公司，國藥準(zhǔn)字H20050500。Trizol RNA提取試劑盒、Platinum Taq DNA Polymerase、ThermoScript RT-PCR System 試劑盒(Invitrogen公司)；兔抗鼠NF-κB、兩步法免疫組化試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)。

1.2分組造模及給藥120只大鼠隨機(jī)均分為：空白組、模型組，吡格列酮組，丹參高、中、低劑量組。采用UUO〔1〕造模方法，各組均于模型建立前48 h灌胃，丹參灌胃量分別按3、2、1 g·kg-1·d-1灌胃給藥，每日給藥一次。模型組以等量生理鹽水灌胃。吡格列酮組灌胃量為30 mg·kg-1·d-1。

1.3病理檢測以造模后第7天為觀察時(shí)點(diǎn)，處死各組大鼠，取新鮮腎組織，以10%中性甲醛固定后，分別行HE 染色及Masson 染色，光鏡下觀察腎小管間質(zhì)的結(jié)構(gòu)變化，同時(shí)進(jìn)行腎間質(zhì)慢性病變(包括腎小管萎縮和間質(zhì)纖維化)評分：200倍光鏡下盲法隨機(jī)取互不重疊的10個(gè)視野，間質(zhì)纖維化：無(0分)、<相應(yīng)視野區(qū)域25%(1分)、相應(yīng)視野25%～50%(2分)、>相應(yīng)視野50%(3分)；腎小管萎縮：無(0分)、<相應(yīng)視野區(qū)域25%(1分)、相應(yīng)視野25%～50%(2分)、>相應(yīng)視野50%(3分)。由兩個(gè)觀察者對每個(gè)樣本腎組織進(jìn)行盲法評分，取平均值，代表各樣品的腎小管間質(zhì)損傷程度。

1.4免疫組化檢測免疫組化染色采用SP法步驟：3 μm石蠟切片脫蠟，水化后以3%H2O2去離子水孵育，以阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，抗原熱修復(fù)，正常山羊血清封閉后，分別滴加一抗NF-κB、PPAR-γ孵育，再依次加入生物素標(biāo)記的羊抗兔IgG，辣根過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉卵白素工作液孵育。應(yīng)用DAB溶液顯色，自來水充分沖洗，蘇木素復(fù)染，脫水，透明，封片。每次染色均以PBS代替一抗做陰性對照。在每張切片不包含腎小球和血管的間質(zhì)區(qū)域隨機(jī)選取10個(gè)高倍鏡視野(×200)，用彩色病理圖文報(bào)告分析系統(tǒng)對所選取視野中免疫組化陽性信號進(jìn)行圖像分析，計(jì)算每個(gè)視野中NF-κB、PPAR-γ各自陽性染色面積占總視野面積的百分比，并計(jì)算其均值。

1.5NF-κB mRNA、PPAR-γ mRNA的檢測采用RT-PCR技術(shù)：應(yīng)用Trizol試劑盒提取腎組織總RNA，運(yùn)用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以β-actin為內(nèi)對照，進(jìn)行半定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)。引物設(shè)計(jì)如下：NF-κB：上游引物5'-ATCTGTTTCCCCTCATCTTTCC-3'，下游引物5'-TGGGTGCGTCTTAGTGGTATCT-3'，擴(kuò)增片段長度1 872 bp。PPAR-γ：上游引物5'-TGACCACTCCCATTCCTTTG-3'，下游引物5'-TTTCCTGTCAAGATCGCCCT-3'，擴(kuò)增片段長度250 bp。β-actin：上游引物5'-TCCTCTGACTTCAACAGCGACACC-3'，下游引物：5'-TCTCTCTTCCTCTTGTGCTCTTGG-3'，擴(kuò)增片段長度為216 bp。均經(jīng)測序鑒定證實(shí)。聚合酶鏈反應(yīng)條件根據(jù)RT-PCR試劑盒推薦條件優(yōu)化，每次PCR反應(yīng)至少重復(fù)3次。PCR產(chǎn)物用含0.5 mg/L溴乙啶的1.5%瓊脂凝膠電泳分析。根據(jù)雙標(biāo)準(zhǔn)曲線法，以目的基因與β-actin基因mRNA水平比值作為目的基因mRNA的相對表達(dá)量，比值越大，說明目的基因的表達(dá)越少。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行單因素方差分析，方差不齊者改用秩和檢驗(yàn)的Kruskal-Wallish方法。

2結(jié)果

2.1丹參對模型大鼠腎臟組織病理形態(tài)的影響HE、Masson 染色觀察：UUO 模型組出現(xiàn)腎間質(zhì)炎細(xì)胞浸潤，纖維組織增生，伴有大部分腎小管上皮細(xì)胞顆粒、空泡變性，部分腎小管上皮細(xì)胞壞死脫落，可見腎小管灶狀萎縮，部分腎小管腔可見脫落壞死組織及細(xì)胞形成顆粒管型及細(xì)胞管型；吡格列酮組、丹參組病理變化較UUO模型組減輕，其中尤以丹參高劑量組減輕最明顯。腎間質(zhì)病變積分顯示，與模型組(2.005±0.033)比較，空白組、吡格列酮組、丹參高、中、低劑量組積分均降低(0.288±0.13、1.573±0.115、1.456±0.127、1.780±0.083、1.833±0.143)；與吡格列酮組比較，丹參高劑量組降低差異顯著(P<0.05)。

2.2各組大鼠腎組織NF-κB及PPAR-γ的表達(dá)與空白組比較，模型組腎小管上皮細(xì)胞、腎間質(zhì)細(xì)胞核NF-κB 強(qiáng)陽性表達(dá)，吡格列酮組及丹參各劑量組NF-κB 表達(dá)水平低于UUO 模型組(P<0.05)；與空白組相比較，模型組及各治療組PPAR-γ表達(dá)明顯降低(P<0.05)，與模型組比較，丹參高、中劑量組PPAR-γ表達(dá)增高，其中丹參高劑量組表達(dá)增高有統(tǒng)計(jì)學(xué)(P<0.05)。見表1。

2.3各組大鼠腎組織NF-κB mRNA及PPAR-γ mRNA的表達(dá)與空白組比較，模型組NF-κB mRNA表達(dá)明顯增強(qiáng)(P<0.01)；各藥物治療組NF-κB mRNA的表達(dá)均較模型組降低，但組間差異不明顯。與空白組比較，模型組PPAR-γ mRNA明顯降低(P<0.05)，各藥物治療組PPAR-γ mRNA的表達(dá)均較模型組升高(P<0.05或P<0.01)，與吡格列酮組比較，丹參高劑量組PPAR-γ mRNA的表達(dá)升高明顯(P<0.05)。見表2。

組別陽性表達(dá)面積NF-κBPPAR-γ空白組0.48±0.230.32±0.10模型組2.68±0.232)0.27±0.181)吡格列酮組0.97±0.213)0.28±0.111)丹參高劑量組0.68±0.263)0.30±0.013)丹參中劑量組0.81±0.563)0.28±0.011)丹參低劑量組0.89±0.333)0.27±0.011)

與空白組比較：1)P<0.05;2)P<0.01；與模型組比較：3)P<0.05

組別NF-κBPPAR-γ空白組1.29±0.221.25±0.16模型組1.13±0.331)1.62±0.121)吡格列酮組1.26±0.161.27±0.212)丹參高劑量組1.32±0.761.20±0.333)4)丹參中劑量組1.23±0.351.25±0.673)丹參低劑量組1.24±0.121.26±0.323)

與空白組比較：1)P<0.01；與模型組比較：2)P<0.05;3)P<0.01；與吡格列酮組比較：4)P<0.05

3討論

大量研究資料表明〔2,3〕，各種腎臟疾病在發(fā)生發(fā)展過程都會出現(xiàn)不同程度的炎癥細(xì)胞浸潤、腎小管萎縮、腎間質(zhì)纖維化等一系列病理過程。腎間質(zhì)纖維化的程度是決定腎臟疾病預(yù)后的最重要因素之一。UUO模型由于尿液排出受阻，腎盂及腎小管壓力增高，腎盂等集合管系統(tǒng)擴(kuò)張，腎間質(zhì)水腫，局灶性炎癥細(xì)胞浸潤，最終導(dǎo)致腎間質(zhì)纖維化。

NF-κB在多種組織器官損傷中具有中心調(diào)控作用，可參與促進(jìn)炎癥性細(xì)胞因子和趨化因子的產(chǎn)生、成纖維細(xì)胞的增生分化、ECM交聯(lián)及細(xì)胞凋亡等過程，并參與了腎組織損害過程，促進(jìn)腎臟疾病的進(jìn)展。因此在許多腎臟疾病發(fā)生發(fā)展過程中的作用不容忽視，特別是其致炎及致纖維化作用〔4〕。

PPARs是一類配體激活的核轉(zhuǎn)錄因子超家族成員之一。已經(jīng)證實(shí)腎臟組織和細(xì)胞中表達(dá)PPARs，并且在慢性腎臟病進(jìn)展過程中，PPAR-γ表達(dá)量呈下降趨勢。在UUO大鼠模型中，腎組織PPAR-γ表達(dá)增加，阿伐他汀可以顯著增加PPAR-γ表達(dá)，從而改善腎間質(zhì)纖維化〔5,6〕。

中醫(yī)學(xué)〔7〕認(rèn)為腎纖維化的形成主要由氣滯血瘀、痰濕交阻、經(jīng)絡(luò)閉阻等相互影響而成，治療上主要以活血化瘀、攻毒泄?jié)嵘⒔Y(jié)為主。病程中腎臟病理學(xué)得改變、凝血機(jī)制的激活以及微血栓的形成均與中醫(yī)學(xué)所說“血瘀”理論相符。研究〔8〕表明活血化瘀藥物是臨床抗纖維化最常使用的一類藥物，而丹參在此類藥物中的使用頻率最高。

本研究結(jié)果表明：丹參在腎間質(zhì)纖維化早期可以通過抑制NF-κB 的表達(dá)，上調(diào)PPAR-γ的表達(dá)，從而減輕腎小管間質(zhì)的微觀病理損害，起到抗腎小管-間質(zhì)纖維化的作用，而且這種作用具有劑量的依賴性，以丹參大劑量效果最為明顯。

參考文獻(xiàn)4

1劉克劍,張悅,李靖,等.單側(cè)輸尿管梗阻法制作大鼠腎間質(zhì)纖維化模型的改進(jìn)〔J〕.中國實(shí)驗(yàn)動物學(xué)報(bào),2007；15(6):410-3.

2Neilson EG.Mechanisms of disease:fibroblasts-a new look at an old problem〔J〕.Nat Clin Pract Nephrol,2011；26(3):347-51.

3Eddy AA.Progression in chronic kidney disease〔J〕.Adv Chronic Kidney Dis,2005；12:353-65.

4Volpini RA,Costa RS,Da Silva CG,etal.Inhibition of nuclear factor-kappaB activation attenuates tubulointerstitial nephritis induced by gentamicin〔J〕.Nephron Physiol,2004；98(4):97-106.

5Kimura H,Li X,Torii K,etal.A natural PPAR-γ agonist 15-deoxy-delta 12,14-prostaglandin J2 may act as an enhancer of PAI-1 in human proximal renal tubular cells under hypoxic and inflammatory conditions〔J〕.Nephrol Dial Transplant,2008；23(4):2496-503.

6劉斌，陳明，彭紅霞，等.阿托伐他汀對單側(cè)輸尿管梗阻大鼠腎小管間質(zhì)過氧化物酶體增殖物激活受體γ表達(dá)的影響〔J〕.中國危重病急救醫(yī)學(xué),2007；19(12):739-41.

7沈慶法.中醫(yī)臨床腎臟病學(xué)〔M〕.上海：上海中醫(yī)藥大學(xué)出版社，2007:63.

8賈秀琴，李雪梅.中藥抗腎纖維化用藥規(guī)律探析〔J〕.中國中西醫(yī)結(jié)合腎病雜志,2006；12(7):739-40.

〔2014-12-09修回〕

(編輯曹夢園)

基金項(xiàng)目：江西省教育廳科學(xué)技術(shù)研究項(xiàng)目(No.GJJ12479)

中圖分類號〔〕R285.5〔

文獻(xiàn)標(biāo)識碼〕A〔

文章編號〕1005-9202(2015)24-7003-02；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2015.24.016