Smad4、TGF-β1、TGF-βR1表達與乳腺癌細胞惡性程度的相關性

陳國平　范平明　夏立平　劉曉力　鄭武平　李京泰　陳峙霖　呂鵬飛

(海南醫學院附屬醫院,海南　海口　570102)

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Smad4、TGF-β1、TGF-βR1表達與乳腺癌細胞惡性程度的相關性

陳國平范平明夏立平劉曉力1鄭武平李京泰陳峙霖呂鵬飛

(海南醫學院附屬醫院,海南海口570102)

摘要〔〕目的探討乳腺癌細胞株與乳腺癌臨床標本中Smad4及轉化生長因子(TGF)-β1、TGF-β受體(R)1的蛋白表達水平與乳腺癌發生、發展、轉移等生物學行為及預后的相關性。方法利用免疫組織化學檢測30例乳腺癌臨床標本Smad4和TGF-β1、TGF-βR1蛋白表達，免疫細胞化學檢測MCF-7、T47D、SKBR-3三種乳腺癌細胞的TGF-β1、TGF-βR1和Smad4蛋白表達，Western 印跡檢測乳腺癌TGF-βR1和Smad4蛋白表達，分析三種乳腺癌細胞TGF-β1、TGF-βR1和Smad4蛋白表達情況。結果免疫組化法結果顯示，Smad4和TGF-βR1的表達水平在低度惡性的MCF-7細胞中明顯高于高度惡性的SKBR-3細胞，中度惡性的T47D細胞介于二者之間。病理類型非浸潤性癌組，TGF-β1、TGF-βR1及Smad4的表達水平明顯高于惡性程度高的浸潤性癌患者組，早期浸潤性癌組介于二者之間。 Western 印跡顯示，惡性程度低的MCF-7細胞，其TGF-βR1和Smad4的蛋白含量明顯高于惡性程度高度的SKBR-3細胞。惡性程度低的患者TGF-βR1和Smad4的蛋白含量明顯高于惡性程度高的患者。結論TGF-β/Smads信號傳導通路活性與乳腺癌的惡性程度呈負相關，Smad4、TGF-β1、TGF-βR1可能在乳腺癌演變中起抑制作用。

關鍵詞〔〕轉化生長因子β1；轉化生長因子β1受體；Smad4；乳腺癌

1南方醫科大學附屬南方醫院

第一作者：陳國平(1978-)，男，主治醫師，主要從事腫瘤外科治療及機制研究。

諸多研究顯示，原癌基因的激活及抑癌基因的失活參與了乳腺癌的發生發展，該病涉及多基因的改變，是一個多因素多階段的演變進程〔1,2〕。轉化生長因子(TGF)- β/Smads信號傳導通路與胰腺及婦科腫瘤的演變有關〔2〕，而在乳腺癌中Smad4、TGF-β1及TGF-βR1三者的表達與相互關系如何，它們對乳腺癌發生、發展起何作用，目前尚未明確。

1材料與方法

1.1標本和細胞選取2005年1月至2008年12月海南醫學院附屬醫院收治的門診或住院乳腺癌患者的臨床標本共30例，其中25例為手術切除標本，5例為病理活檢標本。年齡64～80歲，中位年齡73歲；按照病理結果分為非浸潤性癌4例、早期浸潤性癌6例及浸潤性癌20例。選取非乳腺癌患者手術切除的正常乳腺組織10例作為對照。乳腺癌細胞株MCF-7、T47D、SKBR-3均為本實驗室保存。

1.2試劑兔抗人TGF-β1、TGF-βR1及生物素標記的羊抗兔IgG購自Santa Cruz公司；Smad4抗體購自Abcam公司；二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量試劑盒和硝酸纖維素膜和辣根過氧化酶(HRP)標記的抗兔二抗購自威佳公司。

1.3免疫細胞化學、免疫組織化學檢測取細胞滴片或組織塊切片，參照使用說明書進行固定、血清封閉、孵育、洗滌、二氨基聯苯胺(DAB)顯色等步驟，以兔抗人TGF-β1、TGF-βR1和Smad4為一抗，生物素標記的羊抗兔IgG為二抗，采用SP法進行免疫細胞化學及免疫組織化學檢測。

1.4Western 印跡分析蛋白表達水平取指數增長的MCF-7、T47D、SKBR-3三種乳腺癌細胞和臨床乳腺癌患者標本，提取總蛋白，檢測蛋白含量，十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳、轉膜、封閉、抗體孵育、曝光、顯影、凝膠成像等步驟，按試劑盒說明書測定蛋白含量。

2結果

2.1免疫細胞化學法檢測乳腺癌細胞中Smad4和TGF-βR1的表達惡性程度低的MCF-7細胞中Smad4和TGF-βR1的表達水平明顯高于惡性程度高的SKBR-3細胞。中度惡性的T47D細胞的Smad4和TGF-βR1表達水平介于二者之間。見圖1。

2.2免疫組織化學法檢測乳腺癌臨床標本中TGF-β、TGF-βR1和Smad4的表達病理類型非浸潤性癌組，TGF-β1、TGF-βR1和Smad4的表達水平明顯高于惡性程度高的浸潤性癌患者組。早期浸潤性癌組TGF-β1、TGF-βR1和Smad4表達水平基本介于二者之間。見圖2～圖4。

2.3Western 印跡分析蛋白表達水平惡性程度高的SKBR-3細胞中TGF-βR1和Smad4的蛋白表達量明顯低于惡性程度低的MCF-7細胞。臨床患者中，惡性程度高患者組TGF-βR1和Smad4的蛋白表達量明顯低惡性程度低的患者組。見圖5。

SKBR-3細胞(+)　　T47D細胞(+)　　　MCF-7細胞()圖1　免疫細胞化學法檢測細胞中Smad4蛋白表達(×400)

Smad4(+)　　　　　TGF-βR1(+)　　　TGF-β1(+)圖2　晚期浸潤性癌組TGF-βR1、Smad4和TGF-β1蛋白表達(×400)

TGF-βR1()　　　　Smad4()　　　　　TGF-β1()圖3　早期浸潤性癌組TGF-βR1、Smad4和TGF-β1蛋白表達(×400)

TGF-βR1()　　　　Smad4(+)　　　　TGF-β1()圖4　非浸潤性癌組TGF-βR1、Smad4和TGF-β1蛋白表達(×400)

3討論

TGF-β超家族是一類具有多種生物學活性的細胞生長因子，在調節細胞生長、分化、凋亡、黏附、細胞外基質(ECM)合成及沉積中起重要的作用，并且還參與了胚胎發生和組織修復、炎癥反應與纖維化等病理生理進程。TGF-β可通過下游的信號傳導途徑放大并傳入細胞核內，調節細胞核內的增殖周期調節子、轉錄調節子等，從而對細胞的增殖發揮重要的調節作用〔3〕。TGF-β與細胞膜表面具有絲氨酸/蘇氨酸激酶活性的TGF-βRⅠ和TGF-βRⅡ結合，形成異聚體復合物，激活細胞內相應的信號傳導〔4〕。抑制型Smad(Ⅰ-Smad)可通過阻斷受體下游R-Smad的磷酸化，啟動泛素化作用，抑制TGF-β/Smads信號傳導通道的傳導。該信號通路中的任一個傳導環節的錯誤，傳導蛋白的突變失活或者表達異常，都會導致機體細胞TGF-β生物學效應的丟失，喪失對腫瘤的抑制作用。

國外研究發現〔4〕，與眾多腫瘤一樣，TGF-β在乳腺癌演變過程中扮演著不同的角色。在乳腺癌中，TGF-β負性調控作用能抑制腫瘤生長，調控腫瘤DNA損傷，阻礙腫瘤控制。Smad4作為 TGF-β信號通路最常見的轉導子，對乳腺癌發生及發展同樣起抑制作用〔5〕。另有研究發現，乳腺癌細胞株中雌激素受體陽性者，Smad4 能通過誘導細胞凋亡抑制乳腺癌生長〔6〕；并且在乳腺上皮細胞 Smad4 基因敲除裸鼠中，幾乎100%雌鼠演變成為乳腺鱗狀上皮癌，而雄鼠幾乎沒有，顯示Smad4基因與乳腺癌密切相關，Smad4可能通過雌激素受體途徑抑制乳腺癌發生、發展〔7〕。本研究認為：①TGF-β/Smads信號傳導通路參與了乳腺癌發生、發展過程；②TGF-β/Smads信號傳導通路活性與乳腺癌惡性程度呈負相關，Smad4、TGF-β1、TGF-βR1可能對乳腺癌演變進程起抑制作用。

參考文獻4

1Hudis CA.Current status and future directions in breast cancer therapy〔J〕.Clin Breast Cancer,2003；4(2):S70-5.

2陳可欣,何敏,董淑芬，等.天津市女性乳腺癌發病率死亡率和生存率分析〔J〕.中華腫瘤雜志,2002；24(6):573-5.

3Heldin CH,Landstrom M,Moustakas A,etal.Mechanism of TGF-beta signaling to growth arrest,apoptosis,and epithelial-mesenchymal transition〔J〕.Curr Opin Cell Biol,2009；21(2):166-76.

4Dunning AM,Ellis PD,McBride S,etal.A transforming growth factorbeta1 signal peptide variant increases secretion in vitro and is associated with increased incidence of invasive breast cancer〔J〕.Cancer Res,2003;63(10):2610-5.

5Kaklamani VG,Baddi L,Liu J,etal.Combined genetic assessment of transforming growth factor- β signaling pathway variants may predict breast cancer risk〔J〕.Cancer Res,2005;65(8):3454-61.

6Li Q,Wu L,Oelschlager DK,etal.Smad4 inhibits tumor growth by inducing apoptosis in estrogen recep-tor -α -positive breast cancer cells〔J〕.J Biol Chem，2005;280(29):27022-8.

7Li W,Qiao W,Chen L,etal.Squamous cell carcinoma and mammary abscess formation through squamous metaplasia in Smad4/ Dpc4 conditional knockout mice〔J〕.Development,2003;130(24):6143-53.

〔2015-01-17修回〕

(編輯袁左鳴)

通訊作者：范平明(1980-)，男，副主任醫師，主要從事腫瘤外科治療及機制研究。

基金項目：海南醫學院科研基金資助項目(0020100191)

中圖分類號〔〕R737.9〔

文獻標識碼〕A〔

文章編號〕1005-9202(2015)24-7009-02；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2015.24.019