P38MAPK抑制劑對皮瓣缺血再灌注損傷發展及TNF-α與IL-10表達的影響

羅小鳳

(宜春學院醫學院人體解剖與組織胚胎學教研室，江西　宜春　336000)

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P38MAPK抑制劑對皮瓣缺血再灌注損傷發展及TNF-α與IL-10表達的影響

羅小鳳

(宜春學院醫學院人體解剖與組織胚胎學教研室，江西宜春336000)

摘要〔〕目的探討P38MAPK抑制劑對皮瓣缺血再灌注損傷發展及腫瘤壞死因子(TNF)-α和白細胞介素(IL)-10表達的影響。方法選取48只12～14周齡的健康Wistar大鼠，并將其制作為大鼠腹部軸型淺動靜脈皮瓣模型，按照隨機數字表法將其均分為對照組、缺血再灌注組、生理鹽水組和抑制劑組。術后第7天分別采用酶聯免疫吸附測定法(ELISA)測定各組大鼠的皮瓣存活率和血清TNF-α、IL-10濃度，同時采用免疫組織化學法檢測各組大鼠皮瓣的P38MAPK和P-P38MAPK表達情況。結果①對照、抑制劑組大鼠皮瓣存活率高于缺血再灌注、生理鹽水組(P<0.05)，對照、抑制劑組，缺血再灌注、生理鹽水組之間皮瓣存活率均無統計學差異(P>0.05)；②對照、抑制劑組大鼠血清TNF-α濃度低于缺血再灌注、生理鹽水兩組(P<0.05)，對照、抑制劑組，缺血再灌注、生理鹽水組之間血清TNF-α濃度比較無統計學差異(P>0.05)；抑制劑組大鼠血清IL-10濃度高于對照、缺血再灌注、生理鹽水組(P<0.05)，缺血再灌注、生理鹽水、抑制劑三組大鼠血清IL-10濃度無統計學差異(P>0.05)；③缺血再灌注、生理鹽水、抑制劑組大鼠P38MAPK、P-P38MAPK評分高于對照組，而缺血再灌注、生理鹽水組評分高于抑制劑組(P<0.05)；④皮瓣存活率與TNF-α呈負相關(r=-0.582，P<0.05)，P38MAPK、P-P38MAPK評分與TNF-α均呈正相關(r=0.608、0.775，P<0.05)，皮瓣存活率、P38MAPK、P-P38MAPK評分與IL-10均無相關關系(P>0.05)。結論P38MAPK抑制劑通過抑制皮瓣中P38MAPK信號通路，減少P38MAPK和P-P38MAPK的表達，從而降低血清TNF-α的濃度，減輕缺血再灌注損傷，提高皮瓣的存活率。

關鍵詞〔〕P38MAPK抑制劑；皮瓣；缺血再灌注損傷；腫瘤壞死因子-α；白細胞介素-10

第一作者：羅小鳳(1976-)，女，碩士，講師，主要從事人體解剖學方面的研究。

缺血再灌注損傷是導致皮瓣移植術后壞死的主要因素，也是目前器官、組織移植領域研究的熱點〔1〕。隨著絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號通路在缺血再灌注損傷中的作用逐漸受到重視，越來越多的研究證實了P38MAPK信號通道在多種器官以及組織缺血再灌注損傷中發揮著不同的作用〔2〕。細胞因子作為組織炎癥反應的重要標志物，激活的P38MAPK會促進其分泌和釋放，進而參與缺血再灌注損傷的發生及發展〔3〕。SB202190作為一種P38MAPK抑制劑，它通過阻礙ATP與P38MAPK的結合，可以特異性地抑制P38MAPK信號通道的活性〔4〕。本研究旨在研究SB202190對皮瓣缺血再灌注損傷發展和腦瘤壞死因子(TNF)-α、白細胞介素(IL)-10表達的影響，從而為缺血再灌注損傷的機制研究提供實驗依據。

1材料與方法

1.1實驗動物選取48只健康Wistar雄性大鼠(蘇州大學實驗動物中心提供)，周齡12～14 w，體重250～350 g，未出現特定病原菌級(SPF級)。

1.2實驗儀器、試劑

1.2.1儀器CT14RD-冷凍離心機(由天美公司生產提供)，酶聯免疫檢測儀器(Biotek公司生產)，-80℃超低溫冰箱(Thermo公司生產)，BX51光學顯微鏡以及圖像采集系統(Olympus公司生產)。

1.2.2試劑即用型快速免疫組化試劑盒(基因公司生產)，SB202190(Cayman公司)，在使用之前溶解并配制成0.1 mg/ml的溶液，大鼠TNF-α、IL-10酶聯免疫測定試劑盒(R&D公司)，P38一抗、P-P38一抗(Abcam公司)。

1.3動物模型的建立及分組

1.3.1大鼠皮瓣模型的建立大鼠稱重后注射2%的戊巴比妥鈉(35～40 kg)進行麻醉，麻醉成功后將其固定在手術板上，在手術前進行腹部脫毛、消毒處理，隨后參照有關文獻〔5〕制作腹壁淺動靜脈皮瓣。

1.3.2實驗分組及處理方法按照隨機數字表法將48只大鼠均分為四組，每組12只。對照組對建立的皮瓣模型不進行任何處理，只以3-0絲線對皮瓣切口進行原位縫合；缺血再灌注組在掀開大鼠皮瓣后，通過無損顯微鏡微血管夾將腹壁淺動靜脈夾閉，缺血6 h后將血管夾取出，待腹部淺動靜脈血流恢復正常后對皮瓣進行原位縫合；生理鹽水組，在缺血再灌注組處理的基礎上，于手術后的第2、4、6天向腹腔注射生理鹽水(2 ml/kg)；抑制劑組，在缺血再灌注組處理的基礎上，在手術后的第2、4、6天向腹腔注射SB202190(2 μg/kg)。

1.4觀察指標手術后第7天測定各組大鼠以下指標：(1)皮瓣存活率：采用Image-Pro Plus.V6.0圖像分析系統計算皮瓣的存活率，成活率=成活面積/總面積×100%。(2)血清TNF-α、IL-10濃度：采用酶聯免疫測定法(ELISA)測定各組大鼠的血清TNF-α、IL-10濃度。(3)皮瓣P38MAPK的表達情況：采用免疫組化法測定各組大鼠皮瓣內的P38MAPK表達情況，并參照有關文獻〔6〕對P38MAPK以及P-P38MAPK染色強弱以及陽性細胞數目進行評分：①染色強度計分：無為0，弱為1，中等為2，強為3；②陽性細胞數為含棕黃色顆粒的細胞數目占總細胞數目的比例，其中陽性細胞數目<25%計為1，陽性細胞數目25%～50%計為2，陽性細胞數目>50%計為3。

在進行房屋建筑施工過程中，通常都會遇到一些問題：①材料問題，現在的市場上建筑材料有好有壞，有些企業使用比較好的材料，建筑質量相應的也會更好，但是也有一些企業為了謀求更大的經濟利益，他們往往會選擇比較劣質的材料代替那些質量比較好但價格比較高的材料，這樣情況下建設出來的房屋毋庸置疑是不好的。②施工時的天氣狀況，天氣狀況也會影響到施工質量，試想一下，如果在施工的當天下了雨，那么建筑的混凝土在摻了水的情況下質量就會大大下降，從而影響房屋質量。③地質狀況，如果建筑選址選的不好，出現地基下沉的話，也會對建筑房屋的質量造成影響。

1.5統計學方法應用SPSS19.0軟件，多組定量資料的比較采用方差分析，兩兩比較采用SNK-q檢驗，相關性分析采用Pearson積矩相關分析。

2結果

2.1四組大鼠的皮瓣存活率比較四組大鼠的皮瓣存活率經方差分析有統計學差異(F=8.732，P<0.05)；兩兩比較顯示，對照〔(94.23±2.87)%〕、抑制劑組〔(87.71±2.99)%〕的皮瓣存活率高于缺血再灌注〔(55.82±3.36)%〕、生理鹽水組〔(51.35±3.20)%〕(P<0.05)，對照、抑制劑兩組之間的皮瓣存活率無統計學差異(P>0.05)，缺血再灌注、生理鹽水兩組之間的皮瓣存活率無統計學差異(P>0.05)。

2.2四組大鼠的血清TNF-α、IL-10濃度比較四組大鼠的血清TNF-α濃度經方差分析有統計學差異(F=12.038，P<0.05)；兩兩比較發現，對照、抑制劑組的血清TNF-α濃度〔(149.39±15.82)、(160.12±16.85)ng/L〕低于缺血再灌注、生理鹽水兩組〔(235.65±16.98)、(249.01±17.00)ng/L〕(P<0.05)，對照、抑制劑組，缺血再灌注、生理鹽水組之間的血清TNF-α濃度比較無統計學差異(P>0.05)。四組大鼠的血清IL-10濃度經方差分析有統計學差異(F=10.167，P<0.05)，兩兩比較顯示，抑制劑組〔(75.38±5.26)ng/L〕的血清IL-10濃度高于對照、缺血再灌注、生理鹽水組〔(52.77±5.85)、(54.91±6.03)、(52.14±6.70)ng/L〕(P<0.05)，對照、缺血再灌注、生理鹽水三組的血清IL-10濃度比較無統計學差異(P>0.05)。

2.3四組大鼠的P38MAPK、P-P38MAPK評分比較四組大鼠的P38MAPK、P-P38MAPK評分經方差分析有統計學差異(F=11.982、10.726，P<0.05)，兩兩比較發現，缺血再灌注、生理鹽水、抑制劑組的P38MAPK、P-P38MAPK評分高于對照組，缺血再灌注、生理鹽水組的P38MAPK、P-P38MAPK評分高于抑制劑組(P<0.05)。見表1。

組別nP38MAPK(分)P-P38MAPK(分)對照組122.26±0.931.23±0.57缺血再灌注組125.31±1.041)5.46±0.891)生理鹽水組124.98±0.991)5.01±0.631)抑制劑組123.37±1.031)2)1.96±0.701)2)

與對照組比較:1)P<0.05;與缺血再灌注、生理鹽水組比較:2)P<0.05

2.4皮瓣存活率、P38MAPK、P-P38MAPK評分與TNF-α、IL-10濃度的相關性分析皮瓣存活率與TNF-α呈負相關關系(r=-0.582，P<0.05)，P38MAPK、P-P38MAPK評分與TNF-α均呈正相關關系(r=0.608、0.775，P<0.05)，皮瓣存活率、P38MAPK、P-P38MAPK評分與IL-10均無相關關系(r=0.297、-0.137、-0.316,P>0.05)。

3討論

現有研究表明細胞炎癥因子是造成組織損傷的重要原因之一：釋放的致炎性細胞因子增加血管的通透性及組織水腫，加重缺血損傷；同時，它還能經血液循環到遠處，導致組織器官形態功能的損傷及障礙〔7，8〕。TNF-α作為一種重要的促炎癥細胞因子，可與不同的炎癥介質形成復雜的炎癥反應網絡系統，從而參與組織缺血再灌注損傷〔9〕，血清IL-10作用與TNF-α相反，它是一種抗炎性細胞因子，通過拮抗炎性細胞因子而發揮抗炎作用〔10〕。P38MAPK是介導細胞因子和組織炎癥反應的重要細胞內信號轉導途徑，有研究證實它參與了缺血再灌注損傷的發生及發展過程，而P38MAPK抑制劑可通過抑制組織內P38MAPK的表達，減少炎性因子的生成，并最終抑制過度的炎性反應而減輕缺血再灌注損傷〔11〕。本研究結果顯示，缺血再灌注損傷后大鼠皮瓣存活率降低，而P38MAPK抑制劑有助于減輕缺血再灌注損傷，與有關研究結果〔5〕相似。結果還表明，皮瓣缺血再灌注損傷增強了致炎性細胞因子的作用，加劇了組織的炎癥損傷，而P38MAPK抑制劑減少了致炎性細胞因子的產生。此外，研究還顯示，P38MAPK抑制劑可通過增加抗炎性細胞因子的濃度而減輕組織的炎癥損傷，繼而減輕皮瓣的缺血再灌注損傷。缺血再灌注損傷可能通過激活P38MAPK轉導通路，促進P38MAPK和P-P38MAPK的表達來發揮作用〔4〕，而P38MAPK抑制劑通過抑制P38MAPK的作用可以減輕皮瓣的缺血再灌注損傷。進一步進行的相關性分析提示P38MAPK和P-P38MAPK的生成將促進TNF-α的產生，降低皮瓣缺血再灌注損傷的存活率。與有關研究結果〔5〕一致。但本次研究未發現皮瓣存活率、P38MAPK、P-P38MAPK評分與IL-10存在相關性，原因可能與本研究選取的大鼠樣本量較小有關。因此，在以后相關的研究中，建議增加樣本量進行深入研究。

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〔2015-01-19修回〕

(編輯袁左鳴)

中圖分類號〔〕R62〔

文獻標識碼〕A〔

文章編號〕1005-9202(2015)24-7044-03；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2015.24.034