肝細胞癌中脯氨酸羥化酶1、2、3的表達及其臨床意義

林巧妹　王偉林

(浙江大學醫(yī)學院附屬第一醫(yī)院肝膽胰外科,浙江　杭州　321000)

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肝細胞癌中脯氨酸羥化酶1、2、3的表達及其臨床意義

林巧妹1王偉林

(浙江大學醫(yī)學院附屬第一醫(yī)院肝膽胰外科,浙江杭州321000)

摘要〔〕目的探討肝細胞癌(HCC)中脯氨酸羥化酶(PHD)1、PHD2、PHD3的表達及臨床意義。方法運用組織芯片技術,通過免疫組織化學Envision法檢測103例HCC和14例癌旁肝組織、13例正常組織中PHD1、PHD2和PHD3的表達情況，并結合臨床病理因素進行分析。結果PHD1在HCC中表達明顯高于正常肝組織(P<0.05),而 PHD2在HCC中表達明顯低于正常肝組織(P<0.05),PHD3在HCC中表達明顯高于癌旁肝組織及正常肝組織(P<0.05)。PHD1表達與HCC分化程度、脈管內(nèi)瘤栓、TNM分期和術后3年生存率顯著相關(P<0.05)；PHD2表達與HCC分化程度、TNM分期、包膜侵犯和術后復發(fā)轉移顯著相關(P<0.05)；PHD3表達與肝細胞癌分化程度、脈管內(nèi)瘤栓和術后3年生存率顯著相關(P<0.05)。PHD1與PHD3呈正相關(r=0.274,P=0.001)。生存分析顯示PHD1、PHD3陽性表達患者生存期較陰性表達患者明顯縮短(P<0.05)。COX多因素分析顯示PHD3表達是HCC的獨立預后因素。結論PHD1、PHD2和PHD3在HCC的發(fā)生、發(fā)展中起著不同程度的作用，聯(lián)合檢測PHD1、PHD2和PHD3可能有助于判斷HCC的惡性程度、轉移潛能及預后分析。

關鍵詞〔〕 肝細胞癌；脯氨酸羥化酶；缺氧誘導因子；預后

1麗水市中心醫(yī)院普外科

第一作者：林巧妹(1982-)，女，醫(yī)師，碩士，主要從事普外科研究。

肝細胞癌(HCC)作為實體腫瘤，常因生長較快易出現(xiàn)缺氧，低氧可激活細胞內(nèi)的缺氧誘導因子(HIF)-1，后者通過調(diào)節(jié)多種靶基因表達刺激腫瘤新生血管形成、維持腫瘤細胞的能量代謝、促進腫瘤細胞增殖和轉移〔1〕。因此HIF-1在腫瘤發(fā)生發(fā)展中起重要作用，而脯氨酸羥化酶(PHD) 是調(diào)控HIF-1的關鍵分子，通過催化HIF的脯氨酸殘基發(fā)生羥基化反應介導其降解，是全過程的限速酶〔2〕。至今發(fā)現(xiàn)的脯氨酸羥化酶家族(PHDs)有PHD1、PHD2、PHD3、PHD4四種〔3,4〕，以前三種研究較多，但關于PHDs在肝癌中的研究報道較少。本研究通過檢測HCC中PHD1、PHD2、PHD3的表達，分析其與臨床病理因素的關系，探討其在HCC發(fā)生發(fā)展、浸潤轉移和預后中的作用。

1材料與方法

1.1臨床材料收集麗水市中心醫(yī)院2005年12月至2010年12月手術切除HCC標本103例，全組病人均隨訪至2013年4月，臨床資料和隨訪資料完整。患者術前均未進行放、化療和免疫治療。14例癌旁肝組織選自距HCC邊緣2 cm以上的癌旁肝組織。另取13例經(jīng)病理證實的正常肝組織(取自肝破裂或肝內(nèi)膽管結石行肝切除標本)。103例HCC中男85例，女18例；年齡37～87(平均61)歲；有脈管瘤栓23例；肝癌最大徑>5 cm有26例；高分化(Edmonson分級1～2) 39例，低分化(Edmonson分級3～4)64例；TNM分期Ⅰ和Ⅱ期80例，Ⅲ和Ⅳ期23例；術后出現(xiàn)復發(fā)轉移43例。

1.2組織芯片制作在相應的蠟塊上選定有代表性的區(qū)域并作標記,參照Konomen等創(chuàng)建的方法,用自制組織芯片制作工具在一新的空白受體蠟塊上穿孔(直徑1.8 mm),再用相同內(nèi)徑的空心管從選取的供體蠟塊中穿取組織,準確放入空白蠟塊的小孔內(nèi),依次按序操作,直至將所有組織標本種植于空白蠟塊中。每例取腫瘤1處。再用同法取14例癌旁肝組織及13例正常肝組織標本種植于空白蠟塊中制作組織芯片。

1.3方法采用免疫組織化學技術Envision法,組織芯片4 μm厚連續(xù)切片，常規(guī)脫蠟水化后，采用高壓鍋進行抗原修復。兔抗人PHD1和PHD2單克隆抗體、兔抗人PHD3多克隆抗體均購自英國Abcam公司。PHD1、PHD2、PHD3抗體的工作液濃度分別為1∶150、1∶50、1∶200。抗原經(jīng)pH 6.0的檸檬酸鹽緩沖液高壓鍋煮沸修復處理，然后進行免疫組織化學染色過程。最后鏡下控制DAB 顯色,蘇木素復染和中性樹膠封固。每次染色均用pH 7.2～7.4磷酸鹽緩沖液(PBS)溶液代替一抗作陰性對照,用已知的陽性切片作陽性對照。

1.4結果判定PHD1陽性表達定位于細胞質(zhì)，小部分細胞核中也有表達；PHD2陽性表達定位于細胞質(zhì)；PHD3陽性表達定位于細胞質(zhì)和細胞核，以胞核為主。隨機選擇5個高倍鏡視野，觀察腫瘤細胞或肝細胞的染色強度及比例。采用二級計分法,首先按染色強度評分:無著色0分，淡黃色1分，棕黃色2分，棕褐色3分。再按相應物鏡下陽性細胞所占百分比評分：0分為陰性，1分為陽性細胞<10%，2分為10%～50%，3分為>50%～75%，4分為>75%。上述兩種得分的乘積為綜合免疫組化評分：≤3分為陰性，>3分為陽性。

1.5統(tǒng)計學分析應用SPSS17.0統(tǒng)計軟件行χ2檢驗，生存分析采用Kaplan-Meier法，組間比較用Log-rank檢驗，多因素分析采用Cox回歸模型進行，PHD1～PHD3在HCC組織中表達的相關性采用Spearman等級相關檢驗。

2結果

2.1組織芯片質(zhì)量組織芯片排列整齊，共取材130例，實際有效130例，有效率100%。

2.2HCC和癌旁組織、正常肝組織中PHD1、PHD2與PHD3蛋白的表達比較PHD1在HCC中主要表達于胞質(zhì)，小部分胞核中也有表達，與癌旁肝組織(57.1%)、正常肝組織(23.1%)比較，HCC中高表達(圖1)，陽性表達率為71.8%。PHD1在HCC中表達明顯高于正常肝組織(χ2=12.301，P<0.05)。PHD2在HCC中主要表達于胞質(zhì)，與癌旁肝組織(78.6%)、正常肝組織(84.6%)比較，HCC呈低表達(圖1)，陽性表達率為56.3%。PHD2在HCC中表達明顯低于正常肝組織(χ2=3.840，P<0.05)。PHD3在HCC中主要表達于胞質(zhì)和胞核，以胞核為主，與癌旁肝組織(28.6%)、正常肝組織(15.4%)比較，HCC高表達(見圖1)，陽性表達率為63.1%。PHD3在HCC中表達明顯高于癌旁組織(χ2=6.076，P<0.05)及正常肝組織(χ2=10.775，P<0.05)。

2.3PHD1、PHD2和PHD3的表達與HCC臨床病理特征的關系PHD1表達與HCC分化程度、脈管內(nèi)瘤栓、TNM分期和術后3年生存率顯著相關(P<0.05)；PHD2表達與HCC分化程度、TNM分期、包膜侵犯和術后復發(fā)轉移顯著相關(P<0.05)；PHD3表達與HCC分化程度、脈管內(nèi)瘤栓和術后3年生存率顯著相關(P<0.05)。見表1。

2.4PHD1、PHD2和PHD3表達的相關性經(jīng)Spearman等級相關分析，PHD1和PHD3在HCC中表達呈正相關(r=0.274，P=0.001)。而PHD2與PHD1、PHD3間無相關性。

2.5PHDs表達與預后的關系PHD1、PHD3表達與HCC術后病人生存有關，經(jīng)Log-rank檢驗，PHD1、PHD3陽性表達與陰性表達組生存時間的差異有統(tǒng)計學意義(χ2=5.415，P=0.020；χ2=4.007，P=0.045)，PHD1、PHD3陽性表達組生存時間較短。但PHD2表達與HCC患者生存無關。采用逐步回歸法進行COX比例模型多因素分析，結果顯示PHD3表達、脈管瘤栓、TNM分期是HCC的獨立預后因素。見圖2。

表1HCC不同臨床特征中PHD1、PHD2和PHD3蛋白表達的比較〔n(%)〕

病理特征nPHD1陽性χ2值P值PHD2陽性χ2值P值PHD3陽性χ2值P值腫瘤大小(cm) ≤57738(49.4)2.0080.15622(28.6)2.7170.09932(41.6)0.5630.453 >52617(65.4)12(46.2)13(50.0)分化程度 高分化3916(41.0)3.8610.0498(20.5)4.4330.03510(25.6)8.3110.004 低分化6439(60.9)26(40.6)35(54.7)脈管內(nèi)瘤栓 無8036(45.0)10.1540.00125(31.3)0.5020.47930(37.5)5.5790.018 有2319(82.6)9(39.1)15(65.2)TNM分期 Ⅰ+Ⅱ期8037(46.3)7.3560.00720(25.0)10.3940.00132(40.0)1.9820.159 Ⅲ+Ⅳ期2318(78.3)14(60.9)13(56.5)包膜侵犯 無4924(49.0)0.7330.39211(22.4)4.7140.03020(40.8)0.3140.575 有5431(57.4)23(42.6)25(46.3)術后復發(fā)轉移 無6032(53.3)0.0000.98812(20.0)11.0000.00126(43.3)0.0070.931 有4323(53.5)22(51.2)19(44.2)術后生存時間(個月) <364838(79.2)23.9870.00014(29.2)0.6000.43831(64.6)15.9510.000 ≥365517(30.9)20(36.4)14(25.5)

PHD1

PHD3

圖1HCC中PHD1、PHD2、PHD3陽性表達(Envision,×400)

圖2　PHD1、PHD 2、PHD 3表達與HCC術后病人生存時間的比較(生存曲線)

3討論

PHDs是一種重要的氧感受器，通過催化脯氨酸殘基羥基化來介導HIF降解，是調(diào)節(jié)HIF水平和轉錄活性、維持氧穩(wěn)態(tài)的重要酶類，它在腫瘤發(fā)生發(fā)展中起重要作用。PHD1～3在不同類型的正常組織和腫瘤中表達水平、分布有差別〔5〕，且PHD的不同亞型在血管生成、腫瘤形成、細胞生長分化存活等病理生理過程中發(fā)揮不同作用〔6〕。PHDs在許多腫瘤細胞中都有不同程度的表達，如頭頸部鱗癌、乳腺癌、肝癌、胰腺癌、結腸癌、黑色素瘤、非小細胞肺癌等〔7,8〕。腫瘤常因生長快出現(xiàn)缺氧微環(huán)境，低氧時PHD活性降低，對HIF降解減少，導致HIF大量積聚，調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、促紅細胞生成素(EPO)、內(nèi)皮素-1、轉鐵蛋白、血紅蛋白加氧酶(Glu)-1、胰島素樣生長因子(IGF)-α等基因表達，這些產(chǎn)物參與腫瘤細胞代謝、血管擴張、新血管生成等過程〔7〕。

本研究提示PHD1與惡性腫瘤細胞侵襲性密切相關，PHD1可能通過對腫瘤形成后的生長及血行轉移起作用，其高表達可促進惡性腫瘤細胞轉移。PHD1在一定程度上影響HCC術后腫瘤的復發(fā)、生存時間。但在小鼠異種移植實驗中，增加PHD1的表達可以抑制HIF的穩(wěn)定、減少VEGF的分泌，使微血管生成減少，進而抑制結腸癌生長〔9〕，可能PHD家族成員在不同類型腫瘤中及控制腫瘤生長方面的功能有所不同，有待進一步研究。

PHD2是降解HIF-1α的主要酶類，缺氧時PHD2活性降低，導致HIF大量積聚，編碼VEGF增多，刺激內(nèi)皮細胞脫離臨近血管向刺激處遷移并增殖，形成新的毛細血管網(wǎng)，該過程即血管生成，新的血管生成后有利于腫瘤的浸潤轉移〔10〕。本研究結果顯示PHD2在HCC組織中陽性率顯著低于正常肝組織，本實驗結果與王照紅等〔11〕報道基本一致，即HCC組織中PHD2表達降低，可引起血管的大量新生及異常分化，向HCC提供豐富的血供及生長所需的養(yǎng)分，促進腫瘤的生長及侵襲轉移。本實驗提示PHD2在低分化、有包膜侵犯、存在術后復發(fā)轉移、TNM分期Ⅲ～Ⅳ期的HCC患者中高表達，證實PHD2與HCC的侵襲性轉移、術后復發(fā)有關。沈文狀等〔12〕研究發(fā)現(xiàn)PHD2表達水平與HCC的Edmondson分級相關，而與腫瘤直徑和是否有轉移或者血管侵犯無明顯關系，說明腫瘤存在異質(zhì)性。有研究表明PHD2是人胃癌一個較強的預后指標〔13〕。

本研究提示，HCC組織中PHD3的表達水平可能對HCC的發(fā)生、發(fā)展起重要作用，并有可能成為預測HCC預后的新指標。Hogel等〔14〕研究發(fā)現(xiàn)，缺氧為腫瘤細胞選擇出那些在低氧環(huán)境下生存能力強且具有高度侵襲性的細胞，使腫瘤更富侵襲性，而PHD3是PHD家族成員中缺氧上調(diào)能力最強的亞型；增加頭頸部鱗癌組織PHD3表達可促進細胞周期由G1期進入S期、增強缺氧下癌細胞的存活，而特異性抑制頭頸部鱗癌細胞PHD3的表達可減少細胞在缺氧情況下的存活，說明PHD3與腫瘤的增殖分化、侵襲轉移密切相關，可作為腫瘤治療的新靶點。

本研究結果還顯示PHD1與PHD3呈正相關，可能機制是：①缺氧環(huán)境下Siah2對 PHD1 和 PHD3的泛素途徑依賴的降解作用增強，繼而導致HIF-1α累積，而Siah2對 PHD2作用不顯著〔15〕。②活性轉錄因子(ATF)4可正調(diào)節(jié)VEGF表達，而ATF4可與PHD1、PHD3相互作用，而與PHD2無明顯相互作用，所以PHD1和PHD3對ATF4的作用可影響腫瘤血管生成及腫瘤的生長〔16〕。本研究還發(fā)現(xiàn)PHD2與PHD1、PHD3無明顯相關，這可能與PHD家族各個成員間作用復雜、受多種因素調(diào)節(jié)有關。如有研究表明,當PHDs調(diào)節(jié)HIF-α蛋白穩(wěn)定性的同時，PHD2和PHD3自身又受到來自HIFs的反饋性向上調(diào)節(jié)〔6〕。PHD2是在常氧情況下在大多數(shù)細胞中數(shù)量最多的亞型，在常氧及弱的缺氧時對HIF-1α起主要調(diào)節(jié)作用；而PHD3是在嚴重且持續(xù)很長時間缺氧情況下調(diào)節(jié)HIF〔5，17〕。

PHDs作為調(diào)節(jié)HIFs的關鍵酶，促使細胞的功能適應低氧的環(huán)境，對維持腫瘤細胞在缺氧微環(huán)境中的生存、血管生成、侵襲浸潤是至關重要的。因此，以PHD為靶點治療HCC是一種十分有前景的治療策略。本實驗結果證實通過檢測PHDs的表達將有助于判斷HCC的惡性程度、轉移潛能及預后分析，為HCC的靶向治療提供了新思路。

參考文獻4

1Li S,Yao D,Wang L,etal.Expression characteristics of hypoxia-inducible Factor-1α and its clinical values in diagnosis and prognosis of hepatocellular carcinoma〔J〕.Hepat Mon,2011;11(10):821-8.

2Tian YM，Mole DR,Ratcliffe PJ,etal.Characterization of different isoforms of the HIF prolyl hydroxylase PHD1 generated by alternative initiation〔J〕.Biochem J,2006;397(1):179-86.

3Taylor MS.Characterization and comparative analysis of the EGLN gene family〔J〕.Gene,2001;275:125-32.

4Oehme F,Ellinghaus P,Kolkhof P,etal.Overexpression of PH-4,a novel putative proline 4-hydroxylase,modulates activity of hypoxia-inducible transcription factors〔J〕.Biochem Biophys Res Comm,2002;296(2):343-9.

5Jokilehto T,Jaakkola PM.The role of HIF prolyl hydroxylases in tumour growth〔J〕.J Cell Mol Med,2010;14(4):758-70.

6Fong GH,Takeda K.Role and regulation of prolyl hydroxylase domain proteins〔J〕.Cell Death Differ,2008;15:635-41.

7朱誠程,周家德.脯氨酸羥化酶在婦科腫瘤中的研究進展〔J〕.現(xiàn)代婦產(chǎn)科進展,2011;20(10):831-2.

8Andersen S,Donnem T,Stenvold H,etal.Overexpression of the HIF hydroxylases PHD1,PHD2,PHD3 and FIH are collectively unfavorable prognosticators for NSCLC survival〔J〕.PLoS One,2011;6(8)；e23847.

9Erez N,Milyavsky M,Eilam R,etal.Expression of prolyl-hydroxylase-1(PHD1/EGLN2) suppresses hypoxia inducible factor-1alpha activation and inhibits tumor growth〔J〕.Cancer Res,2003;63(24):8777-83.

10夏冰清,楊帆,張碩,等.脯氨酰羥化酶研究進展及其與腫瘤的關系〔J〕.南通大學學報(醫(yī)學版)，2010;30(2):142-5.

11王照紅，王志明.肝細胞癌缺氧微環(huán)境下PHD2 的表達及其與血管生成的關系〔J〕.中國普通外科雜志，2010;19(10):1113-7.

12沈文狀，易繼林，李興睿，等．肝細胞癌中PHD2蛋白與HIF-1α蛋白表達的關系及意義〔J〕.華中醫(yī)學雜志，2008;32(2)：116-7．

13Kamphues C,Wittschieber D,Klauschen F,etal.Prolyl hydroxylase domain 2 protein is a strong prognostic marker in human gastric cancer〔J〕.Pathobiology,2012;79(1):11-7.

14Hogel H,Rantanen K,Jokilehto T,etal.Prolyl hydroxylase PHD3 enhances the hypoxic survival and G1to S transition of carcinoma cells〔J〕.PLoS One,2011;6(11):e27112.

15Nakayama K,Frew IJ,Hagensen M,etal.Siah2 regulates stability of prolyl-hydroxylases,controls HIF1alpha abundance,and modulates physiological responses to hypoxia〔J〕.Cell,2004;117(7):941-52.

16Hiwatashi Y,Kanno K,Takasaki C,etal.PHD1 interacts with ATF4 and negatively regulates its transcriptional activity without prolyl hydroxylation〔J〕.Exp Cell Res,2011;317(20):2789-99.

17Appelhoff RJ,Tian YM,Raval RR,etal.Differential function of the prolyl hydroxylases PHD1,PHD2,and PHD3 in the regulation of hypoxia-inducible factor〔J〕.J Biol Chem,2004;279:38458-65.

〔2014-06-24修回〕

(編輯安冉冉/曹夢園)

通訊作者：王偉林(1963-)，男，教授，博士生導師，主要從事肝膽胰外科研究。

中圖分類號〔〕R735.7〔

文獻標識碼〕A〔

文章編號〕1005-9202(2015)23-6834-04；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2015.23.086