慢性腸道炎癥促進肝癌的發展

易宏淦，臧夢雅，吳志遠，朱　正，趙新明，王維虎，曲春楓

(1.廣州醫科大學，廣州　510182；2.中國醫學科學院腫瘤醫院分子腫瘤學國家重點實驗室，北京　100021；

3. 中國醫學科學院腫瘤醫院影像診斷科，北京　100021；4. 中國醫學科學院腫瘤醫院放射治療科，北京　100021)

?

慢性腸道炎癥促進肝癌的發展

易宏淦1,2，臧夢雅2，吳志遠2，朱正3，趙新明3，王維虎4，曲春楓2

(1.廣州醫科大學，廣州510182；2.中國醫學科學院腫瘤醫院分子腫瘤學國家重點實驗室，北京100021；

3. 中國醫學科學院腫瘤醫院影像診斷科，北京100021；4. 中國醫學科學院腫瘤醫院放射治療科，北京100021)

【摘要】目的探討慢性腸道炎癥狀態下菌群結構及構成改變對肝癌進展的影響。 方法 22只雄性乙肝病毒轉基因小鼠在出生后第2周腹腔注射二乙基亞硝胺誘導小鼠原發性肝癌，隨機分為慢性腸炎組(給予含2%葡聚糖硫酸鈉的飲用水)和對照組(給予正常飲用水)。上述小鼠觀察至22周齡。在此期間定期進行肝功能測定，收集糞便進行宏基因組測序。另將4只已發生肝癌的小鼠與7只8周齡肉眼及病理學未見肝癌的小鼠同籠(分2籠)飼養16周。 結果 DSS所誘導的慢性腸炎小鼠與正常飲用水小鼠相比肝功能無顯著改變；DSS誘導的慢性腸炎組小鼠(n=10)在第22周齡時有9只發生彌漫性肉眼可見的肝癌，而正常飲用水小鼠(n=12)僅有2只發生肝癌，腫瘤發生率(P=0.002)和腫瘤數量(P=0.028)有顯著差別；與正常飲用水小鼠相比，慢性腸炎組小鼠腸道菌群中，普雷沃氏菌屬(P=0.022)和厭氧支原體屬(P=0.014)顯著減少；與已發生肝癌小鼠進行同籠飼養的小鼠(n=7)在24周齡時全部發生肉眼可見的肝癌。 結論 慢性腸道炎癥狀態下，腸道菌群改變可促進肝癌進展。

【關鍵詞】慢性腸道炎癥；肝癌；菌群改變

Chronic colitis induced by irritant dextran sodium sulphate

原發性肝癌(primary carcinoma of the liver，HCC)是世界范圍內第三大惡性腫瘤。在我國，慢性乙肝病毒(hepatitis B virus，HBV)感染是肝癌發生的主要危險因素，生活環境的多種因素也影響著肝癌的發生發展[1-2]。近年來，歐美等國家的肝癌發病呈上升趨勢，然而，亞洲包括我國的肝癌發病則呈下降趨勢[3]，有些臨床的觀察流行病學研究指出：這種肝癌的下降趨勢與控制嬰幼兒的慢性HBV感染相關[4-6]。毫無疑問，控制慢性HBV感染能夠顯著降低青少年肝癌以及其它肝病的發生[7]，然而，我們以及其他研究者在江蘇啟東肝癌高發區現場人群中的研究表明，通過改善慢性HBV感染者的飲食結構及飲水水質，低年齡人群中肝癌發病率顯著降低[8-9]。

飲食結構影響著腸道微生物種類及構成，由于肝臟與腸道的特殊解剖關系，肝臟經常接受來自腸道的多種抗原如細菌及其產物的刺激，在臨床研究中發現，腸道的慢性炎癥性疾病常伴有多個器官受累的腸外表現，肝膽系統是腸外病變所主要累及的器官[10]。腸道炎癥常伴隨腸道菌群紊亂，并隨門靜脈遷移至肝臟引起肝臟病變，表明腸道微環境中的協同因素將有可能影響著肝癌的發展進程，然而目前尚無直接的實驗依據。

二乙基亞硝胺(diethylnirtosamine，DEN)是一種基因毒性肝臟致癌劑，在動物研究中，常用DEN來誘導動物的肝癌，以模擬人類肝癌發生過程[11-12]。1985年，Ohkusa等[13]報導了葡聚糖硫酸鈉(dextran sodium sulphate，DSS)誘導的急性結腸炎，DSS結腸炎模型與人類炎癥性腸病特別是潰瘍性結腸炎的病理特征類似。本研究采用腹腔注射DEN在HBV轉基因小鼠中誘導基因毒性以誘發原發性肝癌，通過給予含DSS飲用水造成慢性腸道炎癥，探討腸道慢性炎癥時腸道菌群改變對肝癌發展的作用。

1材料和方法

1.1材料

1.1.1實驗動物

無特定病原體級雄性HBV轉基因小鼠，鼠齡6～8周，體重18～20 g，購自北京大學醫學部實驗動物中心【SCXK(京)2011-0012】，自行繁殖并飼養于中國醫學科學院腫瘤醫院實驗動物中心【SYXK(京)2008-0025】。

1.1.2主要試劑

葡聚糖硫酸鈉(DSS)相對分子量為36 000 ～ 50 000，購自美國MP Biomedicals公司。二乙基亞硝胺(DEN)粉末1 mg，購自美國Sigma公司。乙型肝炎病毒表面抗原診斷試劑盒(酶聯免疫法)購自上海科華生物工程股份有限公司。丙氨酸氨基轉移酶(ALT)測定試劑盒(速率法)購自中生北控生物科技股份有限公司。糞便基因組DNA提取試劑盒(離心柱型)購自天根生化科技(北京)有限公司。λ DNA/Hind Ⅲ(即用型0.1 mg DNA/mL)購自天根生化科技(北京)有限公司。

1.2方法

1.2.1DEN誘導小鼠原發性肝癌

在HBV轉基因小鼠在生后第2周按25 μg/g體重腹腔注射DEN，于小鼠5周齡時選擇雄性小鼠進行尾靜脈采血，采用乙型肝炎病毒表面抗原診斷試劑盒以確定小鼠體內存在乙型肝炎病毒表面抗原的持續表達。對于具有HBsAg持續表達的小鼠分別于小鼠第8周齡，14周齡和16周齡時，采用小鼠B超(visual sonics vevo770)進行肝臟掃描，并選擇上述處理的5只小鼠，打開腹腔獲取肝臟組織再檢查是否存在肉眼可見肝臟結節，采用10%中性福爾馬林將肝葉組織固定，石蠟包埋后進行組織切片，HE染色后顯微鏡下檢查肝癌發生情況。

1.2.2DSS誘導慢性結腸炎

在小鼠第8周齡時將22只小鼠隨機分成慢性腸炎組(n=10)和對照組(n=12)，對照組給予正常飲用水。慢性腸炎組在第8周齡給予含2%DSS的飲用水，持續5 d，隨后改用正常飲用水16 d，作為1個DSS周期，共給予4個DSS周期。

1.2.3糞便基因組提取

在第22周時，無菌條件下采集慢性腸炎組和對照組小鼠糞便，保存于-80℃。按照說明書操作提取糞便基因組DNA。應用NanoDrop 2000C(Thermo Scientific)檢測提取的總DNA的濃度和純度，并采用0.8%的瓊脂糖凝膠電泳鑒定確定DNA的完整性。

1.2.4ALT測定

在每次給予DSS飲用水前后，尾靜脈采血，分離血清。按照丙氨酸氨基轉移酶測定試劑盒(速率法)說明書檢測血清中ALT水平。

1.2.5小鼠肝臟組織學分析

小鼠二氧化碳麻醉后，在肝臟病變最明顯處取1 cm×1 cm大小組織，固定于10%中性甲醛中，石蠟包埋切片后，進行HE染色。

1.2.6混合飼養(Cohouse)

小鼠在2周齡時注射DEN，將已發生肝癌的26周齡小鼠(n=4)與8周齡的雄性鼠(n=7，)進行混合飼養，共2籠：其中1籠包含2只已發生肝癌的小鼠和3只8周齡的雄性鼠，另1籠包含2只已發生肝癌的小鼠和4只8周齡的雄性鼠，共計16周。

1.2.7糞便微生物基因組測序

糞便基因組DNA在博奧生物有限公司擴增16S V4區，采用Ion Torrent平臺進行宏基因組測序，并對測序結果進行生物信息學分析，包括群落結構分析，顯著差異性分析等。

1.3統計學方法

采用SPSS17.0軟件進行統計學分析。計量資料的比較采用t檢驗，檢驗水準α=0.05。計數資料的比較采用χ2檢驗，檢驗水準α=0.05。

2結果

2.1小鼠血清ALT的變化

DSS是一種腸道刺激物可導致小鼠腸炎，但不能進入血液，為排除其對肝細胞的直接損傷作用，通過血清丙氨酸氨基轉移酶的測定，對照組和慢性腸炎組小鼠血清中ALT水平無統計學差異(圖1)，表明DSS沒有直接引起肝細胞損傷。

圖1　小鼠血清ALTFig.1　The level of ALT in serum

2.2小鼠肝臟腫瘤進展的改變

通過飲用DSS導致的慢性腸炎小鼠(n=10)在22周齡時有9只發生彌漫性的肉眼可見的肝癌，肝癌發生率為90.0%(9/10)，光鏡下可見邊界清晰的癌灶，瘤細胞間有豐富的血竇樣間隙；對照組(n=12)小鼠僅有2只發生肝癌，發生率為16.7%(2/12)，兩組肝癌發生率有顯著差別(P=0.002)。在已發生腫瘤的小鼠中，計數腫瘤數量，相較于對照組，慢性腸炎組小鼠肝臟腫瘤的數量明顯增多(P=0.028)(封2圖2)。該結果表明DSS通過誘導慢性結腸炎癥的發生促進了肝癌的發展。

2.3小鼠腸道菌群改變

小鼠糞便微生物宏基因組測序結果顯示，與HBV/DEN對照組(n=5)相比較，在DSS誘導慢性結腸炎組(n=3)中腸道菌群發生了明顯的改變，其中普雷沃氏菌屬(P=0.022)和厭氧支原體屬(P=0.014)顯著減少(彩插1圖3)，該結果表明DSS通過誘導結腸炎癥的發生導致了腸道菌群的改變。

2.4混合飼養(Cohouse)影響肝癌進展

我們將已發生肝癌小鼠(n=4)與8周齡大小DEN處理的HBV轉基因小鼠(n=7，肉眼及病理學未見肝癌)混合飼養(Cohouse)來改變腸道菌群，在第24周齡時全部小鼠發生肉眼可見的肝癌(封2圖4)。

3討論

肝臟是人體最大的實質性器官，有雙重血液供應：肝動脈內是來自心臟的動脈血；門靜脈收集消化道的靜脈血。肝臟大約70%的血液來自門靜脈。因此，肝臟經常接受來自腸道的抗原刺激，包括食物源性抗原和細菌相關抗原。腸道細菌在腸-肝軸中發揮重要作用。人體腸道中的細菌數(1×1013)大約是人體細胞數(1×1012)的10倍[14-15]。腸道細菌參與宿主的正常生理活動，包括營養、行為和應激反應。作為共生菌，這些微生物在人體消化吸收過程中起關鍵作用，腸道細菌通過活化或競爭機制阻止外來病原菌的入侵，當菌群穩態被打破時，腸道細菌通過影響附近和遠端臟器，在疾病發生中起重要作用，此外，腸道細菌也能促進腸上皮細胞分化增殖，在維持腸道屏障功能中起關鍵作用[16]。

持續存在的慢性炎癥在腫瘤發生中發揮重要作用，在人群中的研究發現，腸道細菌可以影響腸外腫瘤包括肝癌和乳腺癌的發展[17]，腸道菌群易位能促進肝纖維化發生[18]。在肝癌的發生和化學劑誘導的炎性腫瘤中，腸道穩態發揮重要作用，Dianne H. Dapito等[19]研究表明，腸道微生物可能通過TLR4促進肝癌發生。本研究中，我們利用DEN誘發小鼠原發性肝癌，同時利用DSS誘導小鼠慢性結腸炎，結果發現慢性腸道炎癥能促進肝癌的進展。利用宏基因組測序方法檢測小鼠糞便細菌，發現在慢性腸道炎癥存在下，腸道細菌有明顯改變，其中普雷沃氏菌屬和厭氧支原體屬顯著減少。同時，鑒于鼠類是嗜糞動物(coprophaga)[20]，我們將已發生肝癌小鼠與肉眼及病理未見肝癌小鼠同籠飼養(Cohouse)，結果發現Cohouse能促進肝癌的進展，具體原因還需進一步研究，根據Damman等[21]研究報道，我們推測Cohouse可能改變了腸道菌群，但還需進一步的研究證實。

參考文獻：

[1]Poon D., Anderson B. O., Chen L. T.,etal. Management of hepatocellular carcinoma in Asia: consensus statement from the Asian Oncology Summit 2009[J]. Lancet Oncol, 2009，10(11)：1111-1118.

[2]Tanaka M., Katayama F., Kato H.,etal. Hepatitis B and C virus infection and hepatocellular carcinoma in China: a review of epidemiology and control measures[J]. J Epidemiol, 2011，21(6)：401-416.

[3]Zhang Y., Ren J. S., Shi J. F.,etal. International trends in primary liver cancer incidence from 1973 to 2007[J]. BMC Cancer, 2015，15(1)：1113.

[4]Chang M. H., You S. L., Chen C. J.,etal. Decreased incidence of hepatocellular carcinoma in hepatitis B vaccinees: a 20-year follow-up study[J]. J Natl Cancer Inst, 2009，101(19)：1348-1355.

[5]Chiang C. J., Yang Y. W., You S. L.,etal. Thirty-year outcomes of the national hepatitis B immunization program in Taiwan[J]. JAMA, 2013，310(9)：974-976.

[6]Chien Y. C., Jan C. F., Chiang C. J.,etal. Incomplete hepatitis B immunization, maternal carrier status, and increased risk of liver diseases: A 20-year cohort study of 3.8 million vaccinees[J]. Hepatology, 2014，60(1)：125-132.

[7]Qu C., Chen T., Fan C.,etal. Efficacy of neonatal HBV vaccination on liver cancer and other liver diseases over 30-year follow-up of the Qidong hepatitis B intervention study: a cluster randomized controlled trial[J]. PLoS Med, 2014，11(12)：e1001774.

[8]Sun Z., Chen T., Thorgeirsson S. S.,etal. Dramatic reduction of liver cancer incidence in young adults: 28 year follow-up of etiological interventions in an endemic area of China[J]. Carcinogenesis, 2013，34(8)：1800-1805.

[9]Chen J. G., Egner P. A., Ng D.,etal. Reduced aflatoxin exposure presages decline in liver cancer mortality in an endemic region of China[J]. Cancer Prev Res (Phila), 2013，6(10)：1038-1045.

[10]Mendoza J. L., Lana R., Taxonera C.,etal. Extraintestinal manifestations in inflammatory bowel disease: differences between Crohn's disease and ulcerative colitis[J]. Med Clin (Barc), 2005，125(8)：297-300.

[11]Vesselinovitch S. D. ,Mihailovich N. Kinetics of diethylnitrosamine hepatocarcinogenesis in the infant mouse[J]. Cancer Res, 1983，43(9)：4253-4259.

[12]Druckrey H., Steinhoff D., Preussmann R.,etal. Induction of Cancer by a Single Dose of Methylnitroso-Urea and Various Dialkylnitrosamines in Rats[J]. Z Krebsforsch, 1964，66(1-10.

[13]Ohkusa T. Production of experimental ulcerative colitis in hamsters by dextran sulfate sodium and changes in intestinal microflora[J]. Nihon Shokakibyo Gakkai Zasshi, 1985，82(5)：1327-1336.

[14]Guarner F. ,Malagelada J. R. Gut flora in health and disease[J]. Lancet, 2003，361(9356)：512-519.

[15]O'Keefe S. J. Nutrition and colonic health: the critical role of the microbiota[J]. Curr Opin Gastroenterol, 2008，24(1)：51-58.

[16]Rawls J. F., Samuel B. S. ,Gordon J. I. Gnotobiotic zebrafish reveal evolutionarily conserved responses to the gut microbiota[J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 2004，101(13)：4596-4601.

[17]Rogers A. B. Distance burning: how gut microbes promote extraintestinal cancers[J]. Gut Microbes, 2011，2(1)：52-57.

[18]Darnaud M., Faivre J. ,Moniaux N. Targeting gut flora to prevent progression of hepatocellular carcinoma[J]. J Hepatol, 2013，58(2)：385-387.

[19]Dapito D. H., Mencin A., Gwak G. Y.,etal. Promotion of hepatocellular carcinoma by the intestinal microbiota and TLR4[J]. Cancer Cell, 2012，21(4)：504-516.

[20]Elinav E., Thaiss C. A. ,Flavell R. A. Analysis of microbiota alterations in inflammasome-deficient mice[J]. Methods Mol Biol, 2013，1040(185-194.

[21]Damman C. J., Miller S. I., Surawicz C. M.,etal. The microbiome and inflammatory bowel disease: is there a therapeutic role for fecal microbiota transplantation?[J]. Am J Gastroenterol, 2012，107(10)：1452-1459.

〔修回日期〕2015-03-31

研究報告

promote hepatoma development in mice

YI Hong-gan1,2，ZANG Meng-ya2，WU Zhi-yuan2，

ZHU Zheng3，ZHAO Xin-ming3，WANG Wei-hu4，QU Chun-feng2

(1. Guangzhou Medical University, Guangzhou 510182, China; 2.State Key Lab of Molecular Oncology, Beijing 100021,China;

3. Department of Medical Imaging, Beijing 100021,China; 4. Department of Radiation Oncology, Cancer Institute/Hospital,

Chinese Academy of Medical Sciences, Beijing 100021, China)

【Abstract】ObjectiveTo investigate the effect of gut bacteria under chronic colitis on the progression of hepatoma in mice. Methods 22 hepatitis B virus (HBV)-transgenic mice (male, 8 weeks) were randomly divided into two groups, one group (n=10) was fed the drinking water containing 2% dextran sodium sulphate(DSS)to induce chronic colitis and the control group(n=12)was fed with normal drinking water. In order to investigate the effect of gut microbes,7 male HBV-transgenic mice(8 weeks, with no detectable hepatoma under microscopy) were cohoused with 4 mice with hepatoma for 16 weeks. ResultsNo significant liver cell damage was observed in the group of the mice fed with 2% DSS-containing drinking water. By the 22-week old,9 of the 10 mice(90.0%) fed with 2% DSS-containing drinking water, 2 of the 12 mice(16.7%) fed with normal drinking had hepatoma. Both the hepatoma incidence and the tumor numbers in the group of mice fed with DSS-containing water were significantly higher than that in the controls (P=0.002 and P=0.028respetively). Compared to controls, the bacteria family Prevotella (P=0.022) and Anaeroplasma (P=0.014) reduced significantly in the mice with induced chronic colitis. All the mice (n=7) cohoused with the mice with hepatoma had the liver tumor developed at 24-week-old. Conclusion Alterations of gut bacteria under chronic colitis may promote the development of liver cancer.

【Key words】Chronic colitis；Liver cancer；Gut bacteria

doi:10.3969.j.issn.1671.7856. 2015.005.001

【中圖分類號】R332

【文獻標識碼】A

【文章編號】1671-7856(2015) 05-0001-04

[通訊作者]曲春楓，教授，博士生導師，E-mail： quchf@cicams.ac.cn。

[作者簡介]易宏淦(1989-)，男，碩士生，研究方向：慢性炎癥與腫瘤免疫。

[基金項目]973課題“細胞微環境在腫瘤發生發展及侵襲轉移中的作用及機制”(2011CB504205)。