雄性生殖細胞特異性表達綠色熒光蛋白小鼠的繁殖及其表型鑒定

王志茹，李　軍，劉曉梅，吳紅聯，朱德生

(1. 吉林大學公共衛生學院，長春　130021；2. 北京大學實驗動物中心，北京　100871)

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雄性生殖細胞特異性表達綠色熒光蛋白小鼠的繁殖及其表型鑒定

王志茹1,2，李軍2，劉曉梅1，吳紅聯2，朱德生2

(1. 吉林大學公共衛生學院，長春130021；2. 北京大學實驗動物中心，北京100871)

【摘要】目的繁殖雄性生殖細胞特異性表達綠色熒光蛋白(green fluorescent protein，GFP)小鼠，為進行小鼠生殖系統毒性研究提供有效的工具。 方法 將Ddx4-cre轉基因雄鼠與Rosa26mT/mG轉基因雌鼠交配，產生子代動物，利用分子生物學、組織病理學及活體成像等技術，分別從分子、細胞和組織水平對子代及其親代小鼠進行表型鑒定。 結果 PCR結果表明在子代小鼠的睪丸組織中發生了Cre酶介導的特異性基因重組；活體成像可以看到在F1代小鼠的睪丸組織中具有GFP的表達；睪丸冰凍切片及精子熒光觀察顯示GFP主要表達于次級精母細胞、精子細胞和精子中。 結論 雄性生殖細胞特異性表達GFP小鼠繁殖成功。

【關鍵詞】睪丸；特異性；基因重組；綠色熒光蛋白

生殖系統的改變是造成不孕不育的重要原因，如何簡易快速的檢測生殖系統的損傷是目前研究的一個熱點。在絕大多數物種中，Ddx4基因特異性表達于生殖細胞中[1]，常被用作分子標記研究配子發生和原始生殖細胞的起源、遷移、分化等方面。雄性生殖細胞的 DDX4 蛋白表達，從12.5dpc生殖嵴一直持續到減數分裂后的精子細胞[2]。本研究利用生殖系統特異性啟動子Ddx4啟動的Cre酶，通過Cre/loxP位點特異性重組系統[3]產生雄性生殖細胞特異性表達GFP小鼠模型，為后續進行雄性小鼠生殖系統發育和毒性研究提供理想的動物模型。

1材料和方法

1.1實驗動物

SPF級B6.FVB-Tg(Ddx4-cre)1Dcas/JnjuDdx4-cre小鼠(以下簡稱為Ddx4-cre小鼠)4只，雌雄各半，雄性為雜合子(T/W)，雌性為純合子(T/T)；SPF級B6.129(Cg)-Gt(ROSA)26Sortm4(ACTB-tdTomato,-GFP)Luo小鼠(以下簡稱Rosa26mT/mG小鼠)4只，雌雄各半，均為純合子(mut/mut)。小鼠周齡4～8周，均購自南京大學南京生物醫藥研究院 【SCXK(蘇)2010-0001】。飼養于北京大學實驗動物中心【SYXK(京)2011-0003】，飼養條件符合SPF級實驗動物的飼養標準。

Ddx4-cre小鼠在Ddx4啟動子調控下在生殖系統中特異性表達Cre酶的轉基因小鼠[4]。Rosa26mT/mG小鼠是全身組織器官表達紅色熒光蛋白的轉基因小鼠，當其與Cre轉基因小鼠交配產生的后代將發生Cre酶介導的特異性基因重組，將敲除mT基因，從而激活mG基因的表達，產生綠色熒光蛋白(彩插10圖1)[5]。

1.2動物交配

Ddx4-cre小鼠4只，雌雄各半，雄性為雜合子，雌性為純合子，1∶1交配，擴大種群。

Rosa26小鼠4只，雌雄各半，均為純合子，1∶1交配，擴大種群。

圖2　Ddx4-cre♂小鼠與Rosa26mT/mG♀小鼠交配可能產生的子代的基因型和表型Fig.2　Genotype and phenotype of offspring by mating the Ddx4-cre male mice with the Rosa26mT/mG female mice

Ddx4-cre小鼠6只，雄性，雜合子(T/W)；與Rosa26小鼠6只，雌性，純合子(mut/mut)；1∶1交配，獲得 F1代雄性小鼠，其基因型可分為兩種 Ddx4-cre(T/W)；Rosa26mT/mG(mut /wt)與Ddx4-cre(W/W)； Rosa26mT/mG(mut/wt)。而在表達Cre酶的組織，會產生Cre酶誘導的基因重組，切除mT基因。通過交配產生子代可能的基因型和表型(圖2)。1.3雙陽性F1代雄性小鼠的篩查利用PCR的方法，對母代和子代雄性小鼠進行基因型鑒定。提取鼠尾DNA，PCR擴增檢測Ddx4-cre基因和Rosa26mT/mG基因，確定小鼠基因型，篩選基因型為Ddx4-cre(T/W)；Rosa26mT/mG(mut /wt)的子代小鼠，為雙陽性F1代雄性小鼠。Ddx4-cre基因擴增條件為94℃ 30 s，62℃ 35 s，72℃ 45 s，35個循環；Rosa26mT/mG基因擴增條件為94℃ 30 s，61℃ 1 min，72℃ 1 min，35個循環。所使用的引物及其意義(表1)。

表1　PCR引物、擴增片段及目的

1.4動物分組

為了研究通過交配產生的動物的基因型和表型，我們選取三組動物。Ddx4-cre小鼠4只，雄性，周齡4～5周，為陰性對照鼠；Rosa26mT/mG小鼠4只，雄性，周齡4～5周，為紅色熒光蛋白對照鼠；雙陽性F1代小鼠4只，雄性，周齡4～5周為實驗鼠。

1.5DNA提取

利用濃鹽法提取組織DNA[6]，加入500 μL(含5 μL蛋白酶K)的組織裂解液放到52℃恒溫水浴箱中消化過液，加入5 mol/L NaCl 250 μL，混勻，冰浴10 min。12000 r/min，離心10 min，吸上清400 μL加入1 mL預冷的無水乙醇，12000 r/min 離心10 min后去上清，干燥沉淀后加入60 μL去離子水55℃溶解DNA。

1.6PCR擴增體系

PCR反應體系為20 μL，包括：10×Buffer 2 μL，2.5 mmol/LdNTP 1.6 μL，10μm引物各0.4 μL，5U rTaq酶0.4 μL，模板DNA 1 μL，去離子水14.2 μL。PCR反應產物進行1%瓊脂糖凝膠電泳。

1.7組織mT基因擴增

利用3組動物的睪丸組織(去除被膜組織)及實驗鼠的腦、心、肝、脾、肺、腎、腸，提取DNA，PCR擴增檢測mT基因。引物與目的片段(表1)。擴增條件為94℃ 30 s，61℃ 30 s，72℃ 1 min，35個循環。

1.8組織熒光觀察

頸椎脫臼法處死小鼠，取出腦、心、肝、脾、肺、腎、腸、睪丸，利用小動物成像儀進行離體組織的熒光觀察，紅色熒光(激發光536/40 nm；發射光590/20 nm)；綠色熒光(激發光425/26 nm；發射光520/35 nm)，曝光時間均為1 s。

1.9組織冰凍切片的熒光觀察

將固定于4%甲醛溶液中的組織，轉入6～10 mL 30%蔗糖溶液中沉糖過夜，用OCT膠包埋，儲存于-20℃冰箱中，備用。利用冰凍切片機進行組織切片(10 μm)，無水乙醇固定，DAPI染色，封片，觀察。

1.10精子熒光觀察

分離附睪置于1 mL生理鹽水，將附睪橫切為若干段，用眼科鑷子輕輕擠壓附睪組織塊，去掉附睪。靜止5 min，熒光顯微鏡觀察精子熒光。

2結果

2.1雙陽性F1代雄性小鼠的篩查

通過F1代雄鼠鼠尾DNA PCR檢測，結果(圖3、圖4)證明1-4號F1代雄性小鼠攜帶了父代的Ddx4-cre基因和母代的Rosa26mT/mG基因。

注：M：Maker DL2000；“wt”：野生型。圖3　圖3　Ddx4-cre基因PCR電泳圖Note：M represents Maker DL2000；“wt” represents wild type.Fig.3　PCR electrophoresis of Ddx4-cre

注：M：Maker DL2000；“wt”：野生型。圖4　Rosa26mT/mG基因PCR電泳圖Note：M represents Maker DL2000；“wt” represents wild type.Fig.4　PCR electrophoresis of Rosa26mT/mG

2.2組織mT基因的擴增

雙陽性F1小鼠mT基因的擴增結果顯示只有睪丸組織DNA不能擴增出mT基因(圖5)。雙陽性F1代小鼠睪丸組織mT基因的擴增結果和其親代鼠的睪丸組織DNA 的PCR擴增結果見圖6，F1代小鼠睪丸組織未能擴增出mT基因，而其親代的Rosa26mT/mG鼠睪丸組織DNA可以擴增出mT基因。這表明雙陽性F1小鼠睪丸組織在基因水平上確實發生了Cre酶介導的基因重組。

2.3整體器官熒光觀察

小鼠的離體器官的小動物成像觀察，雙陽性F1代鼠的腦、心、肝、脾、肺、腎、腸、睪丸組織呈現紅色熒光，但睪丸組織可觀察到綠色熒光而其他組織無綠色熒光(彩插10圖7)。

注：1：腦；2：心；3：睪丸；4：肝；5：脾；6：肺；7：腎；8：腸；M：Maker DL2000。圖5　F1 子鼠不同組織mT基因PCR電泳圖Note：1：brain；2：heart；3：testis；4： liver；5：spleen；6：lung；7：kidny；8：gut；M：Maker DL2000.Fig.5　PCR results of mT gene in different tissue in F1 offspring

注：1：F1睪丸組織DNA；2：Rosa26mT/mG鼠睪丸組織DNA；3：Ddx4-cre鼠睪丸組織DNA。圖6　親代和子代動物睪丸組織mT基因PCR電泳圖Note：1： the testis DNA of the F1 mouse;2： the testis DNA of the Rosa26mT/mG mouse;3： the testis DNA of the Ddx4-cre mouse.Fig.6　PCR results of testicular tissue mT gene in F1 offspring and its parents

2.4組織學熒光觀察

雙陽性F1代小鼠和親代小鼠腦、心、肝、脾、肺、腎、腸、睪丸組織冰凍切片結果觀察，發現只有在子代F1睪丸組織細胞中具有GFP的表達(彩插11圖8)，GFP主要表達于生精小管細胞中，且集中于次級精母細胞、精子細胞和精子中。

2.5精子熒光觀察

倒置熒光顯微鏡觀察雙陽性F1代小鼠精子和Rosa26mT/mG鼠精子，結果表明：F1代子鼠精子具有GFP的表達，而其親代的Rosa26mT/mG小鼠的精子呈微弱的紅色熒光(彩插11圖9)。

3討論

熒光蛋白的發現極大地促進了生物學醫藥科學的研究。目前研究較廣泛的熒光蛋白為紅色熒光蛋白(RFP)和GFP，其中GFP享有現代生物學北斗星的美譽，其具有熒光穩定、易于檢測、表達調控簡單、生物安全性好等優點[7]。本研究利用Cre/loxP位點特異性重組系統制作雄性生殖細胞特異性表達GFP小鼠模型，這為我們后續研究雄性小鼠生殖系統功能與毒性等領域提供理想的動物模型。

本實驗將Ddx4-cre雄鼠與Rosa26mT/mG雌鼠交配篩選體內同時具有Cre基因與Rosa26mT/mG基因的雙陽性F1代雄性小鼠，對其進行基因型和表型鑒定。mT基因的擴增結果表明，僅在睪丸組織產生了mT基因的切除。而離體器官的熒光觀察結果表明F1代子鼠的睪丸組織具有GFP的表達，組織學熒光觀察結果證明GFP主要表達于生精小管細胞中，且集中表達于次級精母細胞、精子細胞和精子中。而大量的文獻研究表明DDX4蛋白在小鼠精原細胞與初級精母細胞均有表達[8]，即精原細胞與初級精母細胞應均具有Cre酶的表達而發生特異的基因重組，但在精原細胞與初級精母細胞卻未觀察到綠色熒光，這可能是因為次級精母細胞、精子細胞和精子中綠色熒光強度太強，在同等條件下掩蓋了精原細胞與初級精母細胞的綠色熒光。

參考文獻：

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〔修回日期〕2015-03-31

研究報告

Production and phenotype identification of specific expressed

green fluorescent protein in male mice germ cells

WANG Zhi-ru1,2，LI Jun2，LIU Xiao-mei1，WU Hong-lian2，ZHU De-sheng2

(1. School of public health，Jilin University，Changchun 130021，China；2.Peking University Laboratory animal centre，Beijing 100871，China)

【Abstract】ObjectiveThe aim of this study is production of organ specific animal model for studying reproductive toxicity in mice. Methods F1 generation was gotten by mating the Ddx4-cre transgenic male mice with the Rosa26mT/mG transgenic female mice. F1 offspring and its parents phenotype was screened by molecular biological, histopathological and in vivo imaging technology. ResultsAt molecular level, specific DNA fragment was only found in testis of F1 offspring; At the organ level, the expression of green fluorescent protein could only be observed in testis of F1 offspring; Testicular frozen sections and sperm fluorescence observation showed that green fluorescent protein were mainly expressed in the germ cell lineage such as secondary spermatocyte and spermatocyte and spermatozoon. ConclusionsThe production of the mice with specific germ cell expressed green fluorescent protein by Cre/loxP recombination system were built successfully.

【Key words】Testis；Specificity；Gene recombination；Green fluorescent protein

doi:10.3969.j.issn.1671.7856. 2015.005.007

【中圖分類號】R332

【文獻標識碼】A

【文章編號】1671-7856(2015) 05-0029-04

[通訊作者]朱德生(1960-)， 男，高級工程師，研究方向：轉基因動物，Email：deshengz@pku.edu.cn。

[作者簡介]王志茹(1988-)，女，碩士生，研究方向：納米毒理學，Email：843872569@qq.com。