SSR標記在中藥材分子身份證體系構建中的應用△

周駿輝，袁媛，黃璐琦

(道地藥材國家重點實驗室培育基地 中國中醫科學院 中藥資源中心，北京 100700)

·專論·

SSR標記在中藥材分子身份證體系構建中的應用△

周駿輝，袁媛*，黃璐琦

(道地藥材國家重點實驗室培育基地 中國中醫科學院 中藥資源中心，北京 100700)

簡單重復序列(SSR，simple sequence repeat)是真核基因組上一段短的重復序列，具有分布廣泛和保守性較高的特點，常用于遺傳多樣性分析和物種鑒定。針對現有鑒定方法難以完成藥材近緣種及種下水平基原鑒定，以及栽培產區擴大導致急需建立中藥材種質和農家種鑒定方法的需求，本文簡要介紹了SSR的概念和篩選方法，及其在中藥材分子身份證體系構建中的應用，旨在為中藥鑒定和質量評價體系建設提供參考。

SSR分子標記；中藥材；遺傳多樣性；品種鑒定

中藥作為我國傳統醫學的重要部分，已有上千年的歷史。作為中藥產業的源頭，藥材質量對中藥可持續發展具有重要意義。藥材真偽鑒定是中藥質量評價的關鍵內容之一，已有的研究往往僅側重于藥材基原種間水平的鑒別。然而中藥材品種繁多、產地廣泛，同種藥材在種下水平上也存在遺傳變異，如不同產地的綠桿天麻，其酯酶同工酶譜也不盡相同[1]。并且在長期的栽培過程中形成了豐富的種質資源和農家品種，不同種質資源和農家品種在化學成分和藥理活性上也可能存在差異。田偉等[2]對山東丹參種質資源進行調查，結果顯示，10個種質的產量和丹參酮的含量差異明顯，這將對藥材的質量和臨床療效造成影響。

傳統鑒別技術主要是通過眼看、手摸、鼻聞、口嘗、水試、火試等方法對中藥材的藥用部分進行鑒別[3]。然而對于那些親緣關系較近的正品及其混淆品，尤其是種下水平的基原鑒定，傳統方法就顯得力不從心。通過色譜、波譜等理化鑒定方法對中藥材的活性成分進行檢測可以對藥材的質量進行評價[4]，但活性成分的含量會受到采收時期、產地、栽培方式、加工方式等多種因素的影響。

DNA分子標記技術在中藥鑒定中具有獨特的優勢：一方面，由于生命體基因組變異十分豐富，從而使藥用植物DNA的分子標記也十分豐富；另一方面，DNA分子標記可以對中藥材不同發育時期、不同組織器官進行檢測，且不受環境和基因表達的影響。近年來，DNA分子標記技術已被應用于中藥資源、中藥鑒定、藥材品質形成及質量評價等研究。如利用DNA分子標記技術對梔子進行種質篩選，為優良品種選育打下基礎[5]；對當歸進行遺傳多樣性分析，為種質資源收集保存提供理論依據[6]；在天南星及其混偽品鑒別中，DNA分子標記技術也發揮著重要作用[7]。

目前基于聚合酶鏈式反應(PCR)的分子標記技術主要包括RAPD(random amplified polymorphic DNA，隨機擴增多態性DNA標記)、AFLP(amplified fragment length polymorphism，擴增片段長度多態性)和SSR(simple sequence repeat，簡單重復序列)等。在這些類型的分子標記中，SSR分子標記只需要檢測少量DNA樣品，并且條帶簡單一致。SSR序列還具有較高的多態性、共顯性、含量豐富的特點[8]，非常適合作為分子標記用于中藥材的鑒定工作。

本文主要介紹了SSR的基本原理及分布特點，并對近年來SSR標記在藥用植物研究中取得的成果進行總結和分析，為其在中藥鑒定中的進一步應用提供參考。

1 SSR分子標記概念

SSR是存在于真核生物基因組非編碼區的一段簡單重復序列，在物種進化過程中呈現較為保守的特性，因此常用于DNA指紋圖譜的構建和物種鑒別。SSR序列也被稱為微衛星序列(microsatellites)[9]和短串聯重復序列(short tandem repeat，STR)，通常由2～6個重復的核苷酸構成[10]。

SSR最早在人類基因組的研究中被提出，隨后在其他真核生物中，如哺乳動物、鳥類、魚類、酵母和植物中均有報道[11]。在植物基因組中，每隔21～65 kb就會出現一個SSR位點[12]，且不同基因型中SSR序列的核苷酸重復數目也不盡相同。由于SSR具有這種分布廣泛、含量豐富、種類繁多的特點，其作為分子標記在物種多態性分析方面具有重要應用價值。尤其是SSR呈現出的DNA多態性，能夠對親緣關系較近的物種進行區分，彌補了傳統鑒別方法在近緣物種鑒別中的不足。

2 SSR分子標記的獲取

SSR分子標記主要是從基因組序列、轉錄組序列和EST序列(expressed sequence tag，表達序列標簽)中獲得。隨著高通量測序技術的不斷發展，全基因組測序的成本不斷降低，產生了大量的中藥材基因序列[13]，這些數據便是SSR分子標記的重要來源。SSR通常長度為100～200 bp，并且其兩端序列相對保守，可以由這些保守序列設計特異性引物。目前常用的SSR篩選軟件有SSRHunter、MISA和ssr.pl(http：//www.gramene.org/db/markers/ssrtool)等。

從基因組序列中已獲得了靈芝[14]、黃芩[15]、丹參[16]等中藥材的SSR分子標記，但是大部分藥用植物的基因數據仍未公布。由于SSR序列在物種進化過程中是相對保守的，即SSR側翼序列在屬內種間或有較近親緣關系的屬間有一定的保守性，甚至有部分SSR位點在親緣關系較遠的分類群中也具有保守性[17]，因此，也可利用近緣物種的基因數據獲取SSR序列。如在豆科植物黃芪的研究中，因為黃芪自身的基因信息非常有限，所以很難采用黃芪基因組序列設計相關SSR引物，利用已報道的大豆引物也可成功擴增出黃芪的SSR序列[18]。

與基因組序列相似，轉錄組序列也能作為SSR分子標記的來源[19]，其更多地體現出基因編碼區域的信息，可以更直接地用于基因表達及其藥材性狀相關的研究。且轉錄組測序的成本更低、所包含的信息更多，在中藥資源和中藥鑒定研究中將發揮重要的作用。

EST(expressed sequence tag，表達序列標簽)是通過對cDNA文庫克隆進行大規模測序所獲得的5’或3’端序列，長度一般為 300～500 bp，可代表生物體某一時間內某組織中表達的基因。以EST數據庫為基礎構建SSR標記，即EST-SSR，是目前較為流行的方法。EST-SSR具有很好的保守性，在不同物種間的通用性較好。在NCBI數據庫中收錄了藥用植物的大量EST序列，可用于EST-SSR的開發，降低了EST-SSR的開發成本和時間。盡管EST數據庫可以為SSR標記提供大量來源，但能夠用于引物設計的EST數目卻相對較低[20]。這是因為EST序列長度普遍小于1000 bp，而在這有限的長度內，含有重復序列的EST只有很少一部分，并且在篩選引物過程中還會排除一定數量的EST序列，這就導致了EST數據庫在進行SSR構建時的利用率較低。如NCBI上有10 260條球孢蟲草EST序列，但是最終能夠用于構建SSR分子標記的只有718條序列[21]。

3 遺傳多樣性分析

遺傳多樣性分析結果是構建中藥材DNA指紋圖譜及其DNA身份證的基礎。由于SSR序列表現出較高的多態性和共顯性，并且符合孟德爾遺傳定律，使得SSR分子標記非常適合親緣關系較近物種間遺傳多樣性和遺傳變異的比較[22]。

中藥材種質或農家品種的遺傳多樣性往往與其本身的特性相關，不同種質或農家種間的SSR序列會存在差異。如采集自同一生境下的野生居群魚腥草，利用SSR分子標記分析結果表明，其單株樣本間同樣存在遺傳變異[23]。

篩選適合的SSR標記組合，首先需要進行中藥材種質或農家品種的遺傳多樣性分析。如利用SSR標記對不同產區三七種質進行遺傳多樣性分析，在此基礎上篩選合適的標記，將易感病類型以及遺傳一致度較低的品種進行區分，從而為三七選種和純化提出依據[24]。

4 DNA指紋圖譜與分子身份證

隨著中藥材栽培產區的不斷擴大，同一種質在不同產區出現了性狀特征發生改變的現象，這可能導致新種質的出現；另一方面，在引種的過程中也出現了盲目引種的情況，加劇了種質混亂，難以從源頭上保證藥材的產量和質量。

分子身份證是在指紋圖譜的基礎上發展起來的一種新的電泳圖譜，與指紋圖譜的區別在于分子身份證把品種特征數字化后，采用資源特征分析軟件分析得出字符串形式的結果，這種結果可以簡單明確地區分品種間的差異[25]。分子身份證既能夠鑒別生物個體之間的差異，又能對生物個體的特征進行鑒定，易于存檔記錄和分析比較。分子身份證已被廣泛應用于農作物和果蔬的種質研究中，而在中藥材領域還處于剛剛起步的階段。

利用SSR分子標記構建DNA指紋圖譜可以有效區分表型特征相似的近緣物種、種質資源以及農家種。即依據SSR序列多態性信息，采用不同SSR序列組合，建立每種藥材及其種質或農家種的DNA指紋圖譜，構建中藥材分子身份證體系。如利用3對SSR引物即可區分出忍冬、紅白忍冬和4種山銀花[26-27]；僅用兩對SSR引物就能夠鑒別出恩施產區的厚樸和其他湖北省產地的厚樸[28]。將這些SSR引物的擴增結果轉化為數字信息，即構建了中藥材分子身份證。如在大豆抗性基因相關的SSR標記的研究中，一個大豆品系的分子身份證為3434142，其含義為第一條SSR引物擴增出來的帶型為3，第二條SSR引物擴增出來的帶型為4，以此類推[25]。由于SSR分子標記的多態性和特異性，每個物種的分子身份證也是獨一無二的。這種數字化的種質信息不僅利于保存，更能簡單而準確地鑒別種質差異。本課題組篩選獲得一套金銀花引物，可同時區分不同產地的5份金銀花種質，構建了金銀花分子身份證體系[29]。

5 小結

中藥材是我國獨特且具有戰略意義的寶貴資源，在2015年頒發的《中藥材保護和發展規劃(2015～2020年)》中表明，中藥資源是戰略資源，其種植和保護都是至關重要的。隨著中藥工業產值的激增，中藥材種質資源的保存和管理，以及藥材質量控制都需要明確且有效的方法和標準。SSR分子標記已在物種鑒定、遺傳多樣性分析等方面發揮了重要作用，將其應用到中藥材物種、種質資源以及農家種鑒定，建立標準數據庫和分子身份證體系，不僅有利于中藥材質量控制，還在中藥材種質資源保護、評價與利用以及中藥材新品種選育等領域均發揮重要的推動作用。

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ApplicationofSSRMarkersinEstablishmentofMolecularIdentityforTraditionalChineseMedicinalMaterials

ZHOU Junhui，YUAN Yuan*，HUANG Luqi

(StateKeyLaboratoryofDao-diHerbs，NationalResourceCenterforChineseMateriaMedica，ChineseAcademyofChineseMedicalSciences，Beijing100700，China)

SSR (simple sequence repeat) is eukaryotic DNA sequence that consists of repeat motifs.Because of its wide distribution and high conservation，SSR markers have been widely used in studying genetic diversity and genetic relationships.The existing identification methods are incompetent for differentiating closely related species or infra-species of traditional Chinese medicinal materials.Because of the increasing of traditional Chinese medicinal materials production areas，a more efficient identification method is needed.This review provides brief information on mapping and application of SSR markers，and can be a reference for identifying traditional Chinese medicinal materials.

SSR markers；traditional Chinese medicinal materials；genetic diversity；variety identification

10.13313/j.issn.1673-4890.2016.10.001

2015-11-06)

中醫藥行業科研專項(20140703)；科技基礎性工作專項(2015FY111500)

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袁媛，研究員，研究方向：分子生物學；Tel(010)6401441-2847，E-mail：y_yuan0732@163.com