兩株紫花苜蓿根際芽孢桿菌的篩選及生防效果研究

劉莎莎，程園園，張丹，王曉丹，劉佳莉，郭長虹

(哈爾濱師范大學生命科學與技術學院，分子細胞遺傳與遺傳育種黑龍江省重點實驗室，黑龍江 哈爾濱 150025)

兩株紫花苜蓿根際芽孢桿菌的篩選及生防效果研究

劉莎莎**，程園園**，張丹，王曉丹，劉佳莉，郭長虹*

(哈爾濱師范大學生命科學與技術學院，分子細胞遺傳與遺傳育種黑龍江省重點實驗室，黑龍江 哈爾濱 150025)

摘要：從紫花苜蓿根際土中分離出2株芽孢桿菌(Bacillus spp.)菌株CYY-6和CYY-42，并評價了其對尖孢鐮刀菌(Fusarium oxysporum)的抑制作用，及其對由尖孢鐮刀菌引起的苜蓿根腐病的防治效果。經過形態觀察、16S rDNA序列分析和生理生化鑒定，確定菌株CYY-6為地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)，CYY-42為短短芽孢桿菌(Brevibacillus brevis)。同時檢測發現這2株芽孢桿菌均能不同程度地合成嗜鐵素。在平板對峙實驗中，2株菌株均能對尖孢鐮刀菌產生拮抗作用，并產生抑菌帶，抑菌率分別為49.3%和56.3%。且其發酵液可以致使尖孢鐮刀菌菌絲及孢子生長異常，出現菌絲扭曲、斷裂、破碎，孢子數量明顯減少等現象。在盆栽實驗中，2株菌株對由尖孢鐮刀菌引起的紫花苜蓿根腐病的相對防效分別為57.55%和64.03%，在紫花苜蓿根腐病防治方面具有較好的應用潛力。

關鍵詞：芽孢桿菌；紫花苜蓿；生物防治；尖孢鐮刀菌；根腐病

Isolation, identification, and biocontrol effects ofBacillusspp. from the rhizosphere of alfalfa

LIU Sha-Sha**, CHENG Yuan-Yuan**, ZHANG Dan, WANG Xiao-Dan, LIU Jia-Li, GUO Chang-Hong*

KeyLaboratoryofMolecularCytogeneticsandGeneticBreedingofHeilongjiangProvince,CollegeofLifeScienceandTechnology,HarbinNormalUniversity,Harbin150025,China

Abstract:The aims of this study were to identify two Bacillus spp., CYY-6 and CYY-42, isolated from the rhizosphere of alfalfa, and to evaluate their ability to inhibit Fusarium oxysporum, the causal pathogen of alfalfa root rot. Based on physiological, biochemical, morphological, and 16S rDNA sequencing analyses, strain CYY-6 was identified as Bacillus licheniformis and CYY-42 as Brevibacillus brevis. Both strains were able to synthesize siderophores, although at different levels. In a dual culture assay, both strains inhibited the growth of F. oxysporum. Based on the inhibition zones, the inhibitory rates of CYY-6 and CYY-42 against F. oxysporum were 49.3% and 56.3%, respectively. The fermentation broth of each strain resulted in deformed growth of the mycelia and spores of F. oxysporum. The mycelia were twisted, broken, or fragmented, and the number of spores was significantly decreased. Strains CYY-6 and CYY-42 showed 57.55% and 64.03% inhibition of alfalfa root rot in pot experiments, indicating that both strains have potential applications in controlling alfalfa root rot.

Key words:Bacillus spp.; alfalfa (Medicago sativa); biocontrol; Fusarium oxysporum; root rot

紫花苜蓿(Medicagosativa)是世界上栽培最廣的優質多年生豆科牧草，具有產草量高、再生性強、利用年限長、適口性強、營養豐富等優點。至今，紫花苜蓿在我國的種植歷史已超過兩千年，是我國種植面積最大的牧草[1-3]。然而隨著種植年限和種植面積的增加，紫花苜蓿病害也隨之出現，如根腐病、褐斑病、霜霉病、白粉病等，其中紫花苜蓿根腐病(root rot)是一種世界性病害，會危害紫花苜蓿的各個生長時期，主要癥狀表現為根部出現壞死斑，根莖腐爛中空，側根大量腐爛死亡，莖葉全部枯死，嚴重影響紫花苜蓿的品質和產量[4-6]。據估計，全世界紫花苜蓿每年因根腐病造成的產量損失在20%~40%[5]，而通過對黑龍江省8個地區的紫花苜蓿根腐病進行調查，發現該病害發生普遍，嚴重地塊發病率高達92%，這種病害還會隨著種植面積和年限的增長而加重[7]。雖然紫花苜蓿根腐病病原復雜，但據研究表明多與鐮刀菌有關[4,8-9]。

防治苜蓿根腐病的主要方法有選育苜蓿抗病品種、采取農業措施和使用化學殺菌劑等[5]，但由于苜蓿根腐病屬于土傳病害，上述方法的防治效果往往不太理想。因此，篩選對紫花苜蓿根腐病菌(鐮刀菌)有較強抗性的生防菌株并用于紫花苜蓿生產，將會有效解決紫花苜蓿根腐病病害問題，同時對紫花苜蓿產業的可持續發展具有重要意義。生防菌株一般通過產生抗真菌代謝物或通過誘發系統抗性來防治植物病害[10]。芽孢桿菌是一類好氧或厭氧、桿狀、產芽孢、革蘭氏陽性菌[11]，能夠產生多種抗菌物質，如嗜鐵素、溶菌酶(蛋白酶、幾丁質酶、纖維素酶)和抗真菌脂肽等[10]，因其營養要求簡單、繁殖速度快，能產生抗逆耐熱的芽孢，有利于生防菌劑的制備和劑型的加工生產[12]，因此芽孢桿菌在生物防治方面被廣泛地研究應用。目前，還沒有關于應用芽孢桿菌防治紫花苜蓿根腐病的報道。

本研究從紫花苜蓿根際土中分離鑒定了2株芽孢桿菌菌株，評價其對尖孢鐮刀菌引起的紫花苜蓿根腐病的防治效果，為開發苜蓿根腐病的生防菌劑奠定基礎。

1材料與方法

1.1　土壤樣品采集

供試土樣于2013年9月中旬取于哈爾濱師范大學試驗田中生長的紫花苜蓿根際，將土樣帶回實驗室4℃保存。

1.2　植物病原真菌

尖孢鐮刀菌(Fusariumoxysporum)分離自田間患根腐病的大豆病根，屬大豆專化型，由黑龍江八一農墾大學農學院植物免疫研究室提供。

1.3　培養基

馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基(potato dextrose agar，PDA)、溶菌肉湯培養基(luria-bertani，LB)[13-15]，鉻奧醇培養基(chrome azurol sulphonate，CAS)[16]，改良的金氏B培養基(Modified King’s B，MKB)[17]。

1.4　土樣中芽孢桿菌的分離純化

稱取5 g土樣，加入盛有玻璃珠和45 mL無菌水的錐形瓶中，在培養搖床上劇烈振蕩30 min(37℃)后于80℃的水浴鍋中保持15 min。將懸濁液稀釋10-3、10-4和10-5，從其中各取100 μL于PDA平板上涂布，置于37℃恒溫箱內培養1~3 d，待平板上出現較多單菌落時，在無菌條件下挑取菌落形態、顏色等性狀不同的單菌落于PDA平板劃線純化至第6代，制成甘油菌-80℃保存。

1.5　分離菌株的鑒定

1.5.1分離菌株的16S rDNA序列分析采用CTAB/NaCl方法提取細菌DNA。根據原核生物16S rDNA保守序列通用引物。

F8：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′；F1541：5′-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3′進行擴增。擴增條件：94℃變性3 min；94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸1.5 min(共30個循環)；72℃延伸10 min。將所得產物送至上海生工生物工程股份有限公司進行DNA測序，得到16S rDNA序列后，通過一套在DNA數據庫中進行相似性比較的分析工具(basic local alignment search tool，BLAST)，與數據庫中的已知序列進行同源性分析。

1.5.2生理生化鑒定參照《常見細菌系統鑒定手冊》[14]和《南伯杰細菌鑒定手冊》[15]對菌株進行形態學觀察及生理生化鑒定。

1.6　芽孢桿菌嗜鐵素合成能力的分析

定性測定參照Schwyn和Neilands[16]的方法，將已分離的菌株接種于CAS培養基上，28℃培養2~3 d，觀察菌落周圍培養基上有無形成橘黃色的透明暈圈。

定量測定采用水溶性色素產生菌鐵載體的定量檢測法[17]，等體積的樣品與CAS檢測液反應后，在630 nm處測得的吸光值為A，對照為去離子水加CAS檢測液，測得的值記作Ar，樣品中嗜鐵素的相對含量為A/Ar。

1.7　分離菌株抑菌能力測定

1.7.1平板對峙實驗采用平板對峙法[18]，將植物病原真菌尖孢鐮刀菌接種于PDA平板中央，在平皿四周距邊緣2 cm處接種分離菌株，以只接種尖孢鐮刀菌為對照。28℃下恒溫培養5 d，測量尖孢鐮刀菌菌落半徑，并計算抑菌率：

抑菌率=[(對照菌落半徑-處理菌落半徑)/對照菌落半徑]×100%

1.7.2發酵液對病原菌絲及孢子生長的抑制作用PDA板活化尖孢鐮刀菌，刮取培養基表面菌絲，接種于50 mL PDA液體培養基中。同時，取200 μL過夜培養的細菌發酵液也接入PDA液體培養基中，對照組不接種細菌發酵液。28℃振蕩培養2 d，光學顯微鏡下觀察不同處理尖孢鐮刀菌菌絲及孢子的生長情況[19]。

1.7.3分離菌株對盆栽紫花苜蓿的防病作用參照張璐等[20]的方法，并稍作修改。紫花苜蓿種子經表面殺菌后密播于無菌蛭石中，45 d后，將植株根部用石英砂揉搓制造傷口，分別浸入無菌水和培養2 d的尖孢鐮刀菌孢子懸浮液中40 min，將植株重新種回無菌蛭石(每盆10株)，并實施如下處理：(a)無菌水；(b)接種尖孢鐮刀菌孢子懸浮液和無菌水；(c)接種尖孢鐮刀菌孢子懸浮液且施用CYY-6菌懸液；(d)接種尖孢鐮刀菌孢子懸浮液且施用CYY-42菌懸液。(c)和(d)處理組每2 d用分離菌株制成的菌懸液灌根，(a)和(b)處理組澆灌等量的無菌水。每處理4個重復，接種10 d后觀察記錄病情。參照陳雅君和崔國文[9]的病害嚴重度分級標準，將紫花苜蓿根腐病分為5級：0級為健康植株，無枯萎或腐爛癥狀；1級為主根或根莖局部出現病斑，面積低于10%，地上部分生長良好；2級為主根及根莖出現連片病斑，面積在10%~30%，地上部分生長較好；3級為30%~50%，主根及根莖出現病斑，地上生長很差；4級為主根及根莖部病斑面積超過50%，全株枯死。根據病害嚴重度分級標準計算不同處理的病情指數和防治效果[19]。

1.8　數據統計分析

嗜鐵素合成含量為平均值±SE，使用SPSS 16.0進行統計分析，多重比較采用LSD法。

2結果與分析

2.1　芽孢桿菌的分離與鑒定

從試驗田種植的紫花苜蓿根際土中分離出2株芽孢桿菌菌株CYY-6和CYY-42，用PDA培養基純化后觀察菌落形態，CYY-6菌落扁平，圓形或不規則形，邊緣裂片狀；CYY-42菌落圓形，邊緣整齊或嚙蝕狀。2菌株在接觸酶反應、檸檬酸鹽利用、葡萄糖產酸、明膠液化實驗中均呈陽性；CYY-6在淀粉水解、V-P測定、厭氧生長實驗中均呈陽性，而CYY-20均呈陰性；CYY-6在pH 5.5和9.0及5%和7%(W/V)NaCl的培養基上均能生長，而CYY-42均不能生長(表1)。將已測得的CYY-6和CYY-42菌株的16S rDNA序列與相近種屬的16S rDNA進行比對(圖1)，菌株CYY-6序列與Bacilluslicheniformisstrain KIBGE-IB4與Brevibacillusbrevisstrain MH1(150419319)的同源性達97%，再結合其菌落形態及生理生化特征初步鑒定CYY-6為地衣芽孢桿菌(Bacilluslicheniformis)、CYY-42為短短芽孢桿菌(Brevibacillusbrevis)。

表1　菌株生理生化特征鑒定

注：+，陽性；-，陰性。

Note: +, Positive; -, Negative.(281335878)的同源性達99%，菌株CYY-42序列

圖1　16S rDNA基因序列系統發育樹Fig.1　Phylogenetic tree derived from 16S rDNA gene sequence of CYY-6 and CYY-42　分支點上的數字為自展支持率(%)。括號內序號為菌株在GenBank數據庫中的登錄號。標尺代表序列分歧度。Numbers at each branch points indicate the percentage supported by bootstrap (%). Those in parentheses are the GenBank accession number. Bar represents sequence divergence.

2.2　分離菌株嗜鐵素合成能力分析

菌株CYY-6和CYY-42在CAS檢測培養基上均能夠形成橘黃色透明暈圈，說明兩菌株都具有嗜鐵素合成能力。對兩菌株的嗜鐵素合成能力進行定量測定，一般A/Ar值越小，其合成嗜鐵素的能力越強。如圖2所示，CYY-6嗜鐵素合成量為(2.577±0.091)，而CYY-42嗜鐵素合成量為(1.067±0.006)，由此可知CYY-42合成嗜鐵素能力顯著強于CYY-6(P<0.05)。

圖2　分離菌株嗜鐵素合成量Fig.2　Siderophore synthesis of isolates　　　*表示顯著水平(P<0.05)。 * indicates significant different level (P<0.05).

2.3　分離菌株抑菌能力測定

在PDA平板上，菌株CYY-6和CYY-42對尖孢鐮刀菌的生長都有拮抗作用。如圖3可知，菌株CYY-42對尖孢鐮刀菌的抑制效果好于CYY-6，抑菌帶更加明顯。CYY-6和CYY-42的抑菌率分別為49.3%和56.3%。

圖3　分離菌株對尖孢鐮刀菌的拮抗作用Fig.3　Antagonism of isolates against F. oxysporuma. 對照，b. CYY-6，c. CYY-42。a. Control, b CYY-6, c. CYY-42.

菌株CYY-6和CYY-42的發酵液對尖孢鐮刀菌菌絲和孢子生長均有明顯的抑制作用。在光學顯微鏡下觀察，對照組(CK)菌絲大量生長，邊緣光滑，可見清晰的分支結構，并伴有大量孢子生成。與對照相比，菌株CYY-6處理過的尖孢鐮刀菌菌絲明顯減少，菌絲體扭曲、斷裂，且孢子數量也明顯減少；CYY-42處理過的菌絲斷裂、破碎，細胞壁溶解、原生質泄露，菌絲量和孢子量也明顯減少(圖4)。

圖4　尖孢鐮刀菌菌絲及孢子受拮抗菌作用后的異常形態(40×)Fig.4　Abnormal forms of the F. oxysporum mycelia and spores inhibited by the Bacillus spp. in PDA in vitro (40×)　a. 正常尖孢鐮刀菌菌絲及孢子，b. 受CYY-6抑制的菌絲和孢子，c. 受CYY-42抑制的菌絲和孢子。a. Normal mycelia and spores of F. oxysporum, b. Abnormal mycelia and spores of F. oxysporum inhibited by CYY-6, c. Abnormal mycelia and spores of F. oxysporum inhibited by CYY-42.

分離菌株生防能力的盆栽試驗表明，僅破壞植株根部不接菌(圖5a)，植株根、莖、葉均生長良好，無發病癥狀；僅接種尖孢鐮刀菌的紫花苜蓿(圖5b)，最初幾天部分植株葉片開始逐漸枯萎，10 d后幾乎全部發病，植株根部發黑、腐爛、死亡，莖和葉幾乎全部枯死，病情指數達到86.88%；在用菌株CYY-6和CYY-42接種10 d后， 發病癥狀有所減輕，植株根部出現黑褐色斑點，但并未腐爛、死亡，根部生長良好，植株少量葉片干枯，但莖和葉整體長勢良好，病情指數分別為36.88%和31.25%(圖5c，d)。由此可見，與僅接種尖孢鐮刀菌的對照相比，菌株CYY-6和CYY-42都有防病效果，相對防效分別為57.55%和64.03%。

圖5　分離菌株對苜蓿根腐病的防治作用Fig.5　Biocontrol of root rot in alfalfa with bacterial isolates　　　a. 破壞根部，加無菌水；b. 接種尖孢鐮刀菌，加無菌水；c. 接種尖孢鐮刀菌且施用CYY-6；d. 接種尖孢鐮刀菌且施用CYY-42。a. All plants treated with sterile water; b. All plants treated with F. oxysporum alone; c. All plants treated with F. oxysporum and isolates CYY-6; d. All plants treated with F. oxysporum and isolates CYY-42.

3討論

在可持續農業生產中，應用芽孢桿菌防治植物病害是一個極具潛力的途徑[21]。本研究從紫花苜蓿根際土中分離出地衣芽孢桿菌CYY-6和短短芽孢桿菌CYY-42，評價了其對尖孢鐮刀菌的拮抗作用及由其引起的紫花苜蓿根腐病的防治效果，結果表明，兩菌株顯著減輕了人工接種尖孢鐮刀菌導致的紫花苜蓿根腐病的病情。

尖孢鐮刀菌是一種世界性分布的土傳病原真菌，既可在土壤中存活又能侵染植物。國內外已報道的受尖孢鐮刀菌危害嚴重的植物包括苜蓿、甜椒(Capsicumfrutescens)、花生(Arachishypogaea)、西瓜(Citrulluslanatus)、香蕉(Musaparadisiaca)、高粱(Sorghumbicolor)等[5,22-24]。在平板對峙實驗中，菌株CYY-6和CYY-42均能有效抑制尖孢鐮刀菌生長，并產生抑菌帶，抑菌率分別達到49.3%和56.3%。兩菌株表現出的拮抗活性可能是由于其產生的抗真菌代謝物的作用，如嗜鐵素，其通過螯合反應，釋放出難溶性的鐵，形成嗜鐵素-鐵螯合物，并將鐵轉移到體內，以滿足微生物自身的生長需求，從而降低環境中的鐵濃度，由此病原菌因缺鐵而不能正常的生長繁殖，進而控制植物病害發生[25]。本研究中，菌株CYY-42的嗜鐵素合成能力強于CYY-6，且菌株CYY-42對尖孢鐮刀菌的拮抗效果也比CYY-6好，這一研究結果與Duijff等[26]和許煜泉等[27]發現的現象相似，細菌合成嗜鐵素的含量與拮抗病原菌的能力有關，且呈正相關[28]。菌株CYY-6和CYY-42的發酵液對尖孢鐮刀菌菌絲和孢子生長有明顯的拮抗作用，Pual等[29]和謝棟等[30]也表明芽孢桿菌能夠使真菌菌絲畸形、斷裂，細胞壁溶解，孢子不萌發，這可能與拮抗菌分泌的抗菌肽類或蛋白類物質有關。芽孢桿菌分泌的幾丁質酶具有降解幾丁質的能力，而幾丁質是病原真菌細胞壁的主要結構組成，細菌菌株通過溶解植物病原真菌細胞壁來發揮拮抗作用[23]，因此幾丁質酶可能是生物防治植物病原真菌最重要的物質，Basha和Ulaganathan[31]也表現，新月彎孢菌(Curvularialunata)菌絲的斷裂和細胞壁的溶解與芽孢桿菌菌株分泌的幾丁質酶相關。

生防芽孢桿菌對植物病害的防治機制主要包括拮抗、競爭、誘導植物抗性等多種方式[21]。無生防菌株時，病原真菌依靠植物提供的生存條件進行生長繁殖，有生防菌株存在時，生防菌株與病原真菌競爭，爭奪有利生態位，形成菌膜屏障，阻止病原真菌進一步侵染植物[19]。Lee等[32]篩選到的地衣芽孢桿菌對番茄灰霉病具有顯著防治效果，張璐等[20]從黃瓜根際土分離到的短短芽孢桿菌DS-1對苗期黃瓜枯萎病的生防效果顯著。雖然已經報道了地衣芽孢桿菌和短短芽孢桿菌對一些植物病害有生防活性，但本研究首次報道地衣芽孢桿菌和短短芽孢桿菌能顯著減輕由尖孢鐮刀菌引起的紫花苜蓿根腐病病情。李文英等[23]發現香蕉根際芽孢桿菌PAB-1和PAB-2對由尖孢鐮刀菌引起的香蕉枯萎病的防效為18.8%和46.9%。本研究也表明，從紫花苜蓿根際篩選出的地衣芽孢桿菌菌株CYY-6和短短芽孢桿菌菌株CYY-42對由尖孢鐮刀菌引起的紫花苜蓿根腐病的相對防效分別達到了57.55%和64.03%。

本研究篩選出2株紫花苜蓿根際芽孢桿菌CYY-6和CYY-42，它們對由尖孢鐮刀菌引起的紫花苜蓿根腐病都表現出生防效果，這可能是嗜鐵素、蛋白類或抗菌肽類物質等多種抗真菌代謝物共同作用的結果，其抗菌物質和抑菌機理的確定還有待于深入研究。由于本研究是在盆栽條件下進行的，紫花苜蓿的生長條件及生長期與大田存在一定差異，其實際的生防效果尚待后續田間試驗驗證。

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通訊作者*Corresponding author. E-mail:kaku3008@126.com

作者簡介：劉莎莎(1988-)，女，黑龍江鶴崗人，在讀碩士。E-mail:liusha90923@163.com。 程園園(1987-)，女，黑龍江大慶人，在讀碩士。E-mail:cyy315335@163.com。**共同第一作者 These authors contributed equally to this work.

基金項目：國家自然科學基金項目(No.31470571;31170479)，國家科技支撐計劃項目(No.2011BAD17B04-2-1)，黑龍江省科技攻關項目(No.GC12B304)和黑龍江省自然科學基金項目(No.C201142)資助。

收稿日期：2015-01-16；改回日期：2015-03-30

DOI：10.11686/cyxb2015026http://cyxb.lzu.edu.cn