高效液相色譜法測定甲硝唑片中甲硝唑含量的不確定度評定

北京市門頭溝區藥品檢驗所（102300）徐黎穎

甲硝唑片為《中國藥典》2010年版二部收載的品種[1]，適用于各種厭氧菌引起的感染及炎癥，亦可作為結腸、直腸等擇期手術前的預防用藥，還可用于治療腸道及腸外阿米巴病（阿米巴肝膿腫等）、陰道滴蟲病、小袋蟲病、麥地那龍線蟲病、賈第蟲病等[2]。甲硝唑片的含量測定方法為高效液相色譜法（HPLC）。測量不確定度是表征合理地賦予被測量之值的分散性，與測量結果相聯系的參數。本文根據《測量不確定度評定與表示》、《化學分析測量不確定度評定》、《化學分析中不確定度的評估指南》等有關規定，分析HPLC法測定甲硝唑片中甲硝唑含量的影響因素，對其不確定度進行評定，以期為HPLC法測定化學藥含量的不確定度評定提供參考。

1 測定方法與數據記錄

1.1 儀器與試劑 Agilent 1200S高效液相色譜儀（Agilent公司），AE-100電子天平（METTLER公司），XP-205DR電子天平（METTLER公司），甲硝唑對照品（中國藥品生物制品檢定所，批號：100191-200305），甲硝唑片（批號：121051）。

附表1 對照品溶液實驗數據

附表2 供試品溶液實驗數據

附圖 不確定度的來源分析圖

1.2 液相色譜條件和系統適用性試驗 以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以甲醇-水（20∶80）為流動相；檢測波長為320nm。理論塔板數按甲硝唑峰計算不低于2000。

1.3 對照品溶液的制備 精密稱定甲硝唑對照品約12.5mg，置50mL量瓶中，用流動相溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為對照品溶液。

1.4 供試品溶液的制備 取甲硝唑片20片，精密稱定，研細，精密稱取細粉適量（約相當于甲硝唑0.25g），置50mL量瓶中，加50%甲醇適量，振搖使甲硝唑溶解，用50%甲醇稀釋至刻度，搖勻，濾過，精密量取續濾液5mL，置100mL量瓶中，加流動相稀釋至刻度，搖勻，作為供試品溶液。

1.5 色譜分析方法與數據的記錄 分別精密吸取甲硝唑對照品溶液與供試品溶液各10μL，注入高效液相色譜儀，按外標法以色譜峰面積計算，即為供試品中甲硝唑（C6H9N3O3）的含量。

1.6 數據記錄 20片片重5.7620g，平均片重0.2881g，數據見附表1和附表2。

2 不確定度評定

2.2 不確定度的來源分析 分析實驗過程中不確定度來源見附圖。

2.3 不確定度的量化分析

2.3.1 供試品溶液濃度引入的不確定度urel(Cs)

2.3.1.1 對照品溶液濃度引入的相對標準不確定度urel(Cr)

2.3.1.1.1 對照品的純度引入的相對標準不確定度urel(Pr)對照品由中國藥品生物制品檢定所提供，未提供不確定度值，本實驗參考基準物質的不確定度值，假定對照品含量為100.00%±0.05%，視為矩形分布則對照品純度引入的相對標準不確定度

2.3.1.1.2 對照品稱樣量引入的相對標準不確定度urel(Wr)稱量使用電子天平XP-205DR，實際分度值d＝0.01mg，檢定證書給出載荷點誤差為0.03mg，重復性誤差為0.02mg，則單次稱量的標準不確定度：

采用減重法稱量，上述分量應計算2次，故對照品稱樣量引入的相對標準不確定度：

2.3.1.1.3 對照品的稀釋引入的相對標準不確定度urel(Vr)玻璃量具允差：對照品溶液稀釋過程中用到容量瓶（50±0.05）mL（A級），按矩形分布處理標準不確定度：

環境溫度：實驗環境溫度在空調條件下，設置室溫為（20±5）℃。水的體積膨脹系數為2.1×10-4℃-1，按照矩形分布處理標準不確定度：

2.3.1.1.4 對照品溶液濃度引入的合成相對標準不確定度urel(Cr)

2.3.1.2 對照品溶液峰面積引入的相對標準不確定度urel( Ar)實驗中取對照品溶液r1、r2，分別進樣5次、2次，取峰面積平均值計算。

對照品溶液r1引入的相對標準不確定度：=0.000105；對照品溶液r2引入相對標準不確定度，采用極差法計算，n＝2，C=1.13：=0.000120；對照品溶液峰面積引入的相對標準不確定度 ：=0.000159。

2.3.1.3 供試品溶液峰面積引入的相對標準不確定度urel(As)實驗中供試品溶液t1、t2，分別進樣2次、2次，取峰面積平均值計算。采用極差法分別計算相對標準不確定度，

2.3.1.4 供試品溶液濃度引入的合成相對標準不確定度urel(Cs)

采用減重法稱量，上述分量應計算2次，故供試品稱樣引入的相對標準不確定度：

2.3.3 供試品的稀釋引入的不確定度urel(Vs)

供試品的稀釋過程中分別用到容量瓶（50±0.05）mL（A級）、（100±0.10）mL（A級）、單標線吸管（5±0.015）mL（A級），參照對照品的稀釋引入的相對標準不確定度計算方法。

2.3.3.1 容量瓶（50±0.05）mL（A級）引入的相對標準不確定度

2.3.3.2 容量瓶（100±0.10）mL（A級）引入的相對標準不確定度

2.3.3.3 單標線吸管（5±0.015）mL（A級）引入的相對標準不確定度

2.3.4 平均片重引入的不確定度urel(W)

稱量使用電子天平AE-100，檢定分度值d＝0.1mg，檢定證書中給出載荷點誤差為-0.1mg，重復性誤差為0.1mg，則單次稱量的標準不確定度：采用減重法稱量，上述分量應計算2次，故平均片重引入的相對標準不確定度

2.4 合成標準不確定度

供試品溶液濃度、供試品稱樣量、供試品的稀釋、平均片重等影響因素相互獨立，則合成相對標準不確定度urel(X)：實驗測得X＝95.6%，則標準不確定度u(X)：u(X)=urel( X)×X=0.00638×95.6%=0.61%。

2.5 擴展不確定度

取包含因子k＝2，則含量測定結果的擴展不確定度U（X）：U(X)= k ×u(X)=2×0.61%=1.22%。

3 結果報告

高相液相色譜法測定甲硝唑片中甲硝唑的含量為：X＝（95.6±1.2）% ；k＝2。