睪酮受體蛋白表達水平對高血壓大鼠血管重構的影響*

于超男，王　穎#，燕樹勛，楊國杰，張彥周，楊曉村，李　淵，孫麗娜

1)鄭州大學第一附屬醫院老年病科；河南省高等學校臨床醫學重點學科開放實驗室 鄭州 450052　2)河南中醫學院第一附屬醫院內分泌科 鄭州 450008　3)鄭州大學第一附屬醫院心血管內科 鄭州 450052

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睪酮受體蛋白表達水平對高血壓大鼠血管重構的影響*

于超男1)，王穎1)#，燕樹勛2)，楊國杰1)，張彥周3)，楊曉村1)，李淵1)，孫麗娜1)

1)鄭州大學第一附屬醫院老年病科；河南省高等學校臨床醫學重點學科開放實驗室 鄭州 4500522)河南中醫學院第一附屬醫院內分泌科 鄭州 4500083)鄭州大學第一附屬醫院心血管內科 鄭州 450052

關鍵詞高血壓；睪酮受體；血管重構；絲裂原活化蛋白激酶；磷酸酶

摘要目的：探討睪酮受體(AR)蛋白表達水平的改變對高血壓大鼠血管重構(VR)的影響及其信號轉導機制。方法：將30只大鼠隨機分為對照組、假手術組、高血壓組3組(每組10只)。采用“兩腎一夾”法制備腎血管性高血壓大鼠模型。HE染色觀察主動脈組織形態結構，免疫組化法檢測3組大鼠主動脈組織中AR、絲裂原活化蛋白激酶磷酸酶-1(MKP-1)蛋白表達水平。結果：與對照組相比，假手術組主動脈形態結構基本正常，AR、MKP-1蛋白表達水平無顯著改變(P>0.05)；與對照組及假手術組相比，AR和MKP-1蛋白表達水平下降(P<0.001)；且在高血壓組AR與MKP-1蛋白的表達呈正相關(r=0.657，P=0.039)，在對照組及假手術組無關(r=0.589和0.436，P>0.05)。結論：高血壓VR過程中存在AR及MKP-1蛋白表達水平的改變。

AbstractAim: To explore the effect of the change of androgen receptor(AR) protein expression level on hypertensive vascular remodeling and the underlying mechanisms.Methods:Thirty rats were randomly allocated into 3 groups：control group, sham operation group and hypertensive group(10 rats in each group). The renovascular hypertensive rats model was established using the "2-kidney and 1-clip" method. Using tail-cuff method to measure the systolic blood pressure(pSB) and HE staining to observe the morphological structure of aorta, and the expressions of AR and MKP-1 were detected by immunohistochemical technique. Results: For the morphological structure, there was no significant difference between the control group and the sham operation group, and also no significant difference in the expressions of AR and MKP-1 was found between the two groups(P>0.05). Compared with the control group and the sham operation group，the vascular remodeling of the aorta in the hypertensive group was remarkable, and the expressions of AR and MKP-1 significantly decreased(P<0.001). In the hypertensive group, the expression of AR was positively correlated with the expression of MKP-1(r=0.657,P=0.039), and no such correlation was found in the control group or in the sham operation group(r=0.589，0.436，P>0.05). Conclusion: The vascular remodeling during hypertension is accompanied by the down-regulation of AR and MKP-1.

高血壓血管重構(vascular remodeling，VR)是多種心血管疾病的病理基礎[1]，對其機制的研究是高血壓研究領域的熱點之一。近年來的研究[2-3]結果顯示睪酮與高血壓VR的發生關系密切。睪酮是人體內重要的性激素之一，它的生物學活性主要是通過雄激素受體(androgen receptor，AR)實現的。已證實[4-6]睪酮與AR結合，通過絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)信號通路參與心肌肥大、血栓形成、動脈粥樣硬化等多種疾病的發生。但其在高血壓VR過程中的地位、作用及機制尚不清楚。為此，該研究以腎血管性高血壓大鼠為研究對象，以AR為研究靶點，以MAPK的下游調節激酶——絲裂原活化蛋白激酶磷酸酶-1(mitogen-activated protein kinase phosphatase-1，MKP-1)為視點，探討AR在高血壓VR中的作用、地位及信號轉導機制，為臨床高血壓VR的預防及治療提供新的線索和理論依據。

1材料與方法

1.1實驗動物、主要試劑及儀器4周齡清潔級雄性Wistar大鼠30只，體重(75±5) g，由河南省實驗動物中心提供(動物合格證號:0008508)。兔抗AR和MKP-1多克隆抗體(美國Santa Cruz公司)，抗兔IgG免疫組化檢測試劑盒(北京博奧森生物技術有限公司)，DAB顯色劑(北京中杉金橋生物技術有限公司)。其余產品均為市售分析純。大鼠尾動脈測壓儀(日本Softron公司，BP-98A型)，冰凍切片機(德國LEICA，CM 1900型)，烤片機(德國LEICA，HI 1220型)，Image-Pro Plus 6.0圖像分析系統(Media Cybernetics公司)。

1.2動物分組與模型的建立大鼠隨機分為對照組、假手術組、高血壓組3組 (n=10)。采用“兩腎一夾”法制備腎血管性高血壓大鼠模型:水合氯醛(0.3 mL/kg)腹腔注射麻醉，大鼠仰臥固定于手術臺上，備皮、消毒，打開腹腔，分離左側腎動脈，內徑0.2 mm的“U”型銀夾鉗夾左腎動脈，制作左腎動脈狹窄模型，腹腔注射青霉素鈉，縫合。假手術組除不放置銀夾外，其余操作步驟同上。所有大鼠均用標準飼料喂養，自由飲水，溫度18～23 ℃，濕度50%～60%，人工晝夜(12 h/12 h)循環。術后每周測量血壓1次，連續觀察3周，以術后尾動脈收縮壓(pSB)升高20 mmHg(1 mmHg=0.133 kPa)(或>正常血壓3個標準差)以上且同時>140 mmHg者為造模成功。

1.3血壓測定和主動脈形態學觀察①血壓測定：在造模前、造模后第1、2、3及8周末，采用Tail-Cuff法測量各組大鼠安靜、清醒狀態下尾動脈pSB，每只測3次，取平均值。②取材和形態學觀察：造模后第8周末，大鼠稱重，經腹腔注射水合氯醛麻醉，開胸獲取胸主動脈，洗滌，40 g/L多聚甲醛溶液固定。石蠟包埋，切片，HE染色，顯微鏡下觀察并攝片，圖像分析系統分析VR的指標，包括中層壁厚(MT)、管腔內徑(LD)、中層壁厚/管腔內徑(MT/LD)；選取3個視野，取平均值。

1.43組大鼠胸主動脈組織中AR和MKP-1蛋白表達的免疫組化測定石蠟包埋組織切片、脫蠟，沖洗；體積分數3%H2O2封閉，PBS漂洗；熱修復抗原；正常山羊血清封閉，去液；滴加一抗(均按1100稀釋)，4 ℃孵育過夜；室溫復溫，PBS漂洗；滴加抗兔IgG二抗室溫放置30 min，PBS漂洗；DAB顯色，沖洗，脫水，透明，封片。顯微鏡下觀察并攝片，采用Image-Pro Plus 6.0圖像分析系統測定蛋白表達的平均光密度值。

1.5統計學處理采用SPSS 16.0進行分析，應用重復測量數據的方差分析比較3組大鼠尾動脈pSB的差異，應用單因素方差分析和LSD-t檢驗比較3組VR指標、大鼠主動脈組織中AR及MPK-1蛋白表達水平的差異，兩因素相關性分析采用Pearson檢驗。檢驗水準α=0.05。

2結果

2.13組大鼠尾動脈pSB比較見表1。各組大鼠術前尾動脈pSB差異無統計學意義。與各組相應的術前pSB相比，高血壓組pSB逐漸升高，而對照組及假手術組差異無統計學意義。與對照組相比，8周末時，高血壓組pSB升高顯著，而假手術組pSB差異無統計學意義。

表1　3組大鼠尾動脈pSB的比較　mmHg

F組間=1 211.779，F時間=1 613.225，F交互=1 537.050，P<0.001；*：與對照組相比，P<0.05。

2.23組大鼠主動脈形態學比較見圖1、表2。對照組大鼠主動脈形態大致正常，各層分界清晰，內膜光滑，中膜無增厚，彈性纖維呈層狀排列整齊，平滑肌排列均勻有序、無增生肥大；與對照組相比，高血壓組主動脈內皮細胞增生、排列紊亂，部分內皮細胞脫失，中膜增厚明顯，血管平滑肌細胞增生肥大且排列紊亂，彈性纖維扭曲、紊亂，而假手術組無明顯改變。與對照組相比，高血壓組MT、MT/LD明顯增加，LD減小；而對照組與假手術組相比，差異無統計學意義。

圖1　3組大鼠主動脈HE染色(×400)A：對照組；B：假手術組；C：高血壓組。

表2　3組大鼠VR指標的比較

*：與對照組和假手術組相比，P<0.001。

2.33組大鼠AR和MPK-1蛋白表達的比較見圖2和表3。對照組主動脈內存在基礎量的AR蛋白表達(棕黃色顆粒物，如圖箭頭所示)，且AR在動脈各層均有表達，以內層為主，主要位于細胞核內；MKP-1蛋白(棕黃色顆粒物，如圖箭頭所示)各層均可見。與對照組相比，高血壓組AR蛋白及MKP-1蛋白的表達明顯下降，假手術組變化無統計學意義。Pearson相關分析顯示，在高血壓組AR與MKP-1呈正相關(r=0.657，P=0.039)，在對照組及假手術組無相關關系(r=0.589和0.436，P>0.05)。

圖2　3組大鼠主動脈組織中AR和MKP-1蛋白的表達(SP，×400)1：AR蛋白；2：MKP-1蛋白；A：對照組；B：假手術組；C：高血壓組。

表3　3組大鼠主動脈組織中AR和MPK-1蛋白表達水平的比較

*：與對照組和假手術組相比，P<0.001。

3討論

高血壓VR是高血壓靶器官損害的重要病理生理基礎[7]，嚴重影響高血壓、動脈粥樣硬化、糖尿病等多種疾病的預后。目前高血壓治療策略不只局限于降低血壓，也關注對高血壓VR的防治，故對其機制深入探討研究意義重大。

近年來的研究[8-10]表明，睪酮不僅對生殖系統發揮調節作用，而且與冠心病、高血壓病等多種心血管疾病及其危險因素密切相關。既往課題組研究[11]證實，睪酮能抑制血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)誘導的心肌成纖維細胞增殖及膠原合成，其生物學效應與抑制MAPK過度激活有關，提示睪酮有心血管保護作用。

睪酮的生物學效應主要是通過AR介導的。AR是配體調節的轉錄因子，屬于核受體超家族成員，大多通過基因途徑調控細胞內基因表達而發揮生物學效應。已證實[12]AR廣泛存在于睪丸間質細胞、神經系統、腎臟、心肌、主動脈、冠狀動脈、血管平滑肌細胞及巨噬細胞、單核細胞、血小板等。該研究發現在正常大鼠主動脈壁各層內均存在基礎量的AR表達，主要分布于內層；在腎血管性高血壓大鼠重構的主動脈中，AR蛋白表達水平下調，提示AR蛋白表達水平的改變參與了VR的發生過程，這與既往的研究[13]結果相符。Ikeda等[2]研究發現，在AR基因敲除鼠，AngⅡ刺激顯著增加主動脈內膠原表達，引起中膜厚度增加及血管纖維化，進而導致VR的發生；同時也增加過氧化物物質、脂質過氧化等誘導VR的發生，且該過程伴有NO生物利用度的下降，提示AR通過多種途徑影響VR的發生。

MAPK是細胞外重要的信號傳導通路之一。以往的研究[14]證實，MAPKs過度激活在高血壓VR過程中發揮重要作用。MKP-1是MAPKs的特異性調節磷酸酶，負責MAPKs的失活，在維持MAPKs活性水平的動態平衡中發揮重要作用。課題組既往研究[15]已證實，在高血壓左室重構的發生、發展過程中，不僅僅存在MAPKs的過度激活，同時還合并MPK-1表達下降，即表現為在重構的心血管組織中MKP-1的表達可誘導性減低，導致MAPKs滅活障礙。為此，該研究選擇MKP-1蛋白表達水平為信號轉導通路的一個觀察點。研究發現在正常組織中存在基礎量的MKP-1蛋白表達，在重構的血管中MKP-1蛋白表達下調，并且該現象與AR蛋白表達下調共存，進一步的相關分析證明在高血壓組AR與MKP-1的表達呈正相關。由此推測，在高血壓VR過程中，AR與MAPK信號轉導偶聯、相互作用，共同推進了該過程的發生發展。

綜上所述，在高血壓VR過程中，存在AR及MKP-1蛋白表達水平的下降。提示AR蛋白表達下調參與了高血壓VR過程，并證實與MAPK信號通路偶聯。這可能為臨床高血壓VR及靶器官損害的防治提供新線索和新的藥物靶點。

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*國家自然科學基金項目31160193;云南省教育廳科學研究基金項目2010Y398;云南省應用基礎研究面上項目2010ZC055,2012FB135

Effects of androgen receptor protein expression level on hypertensive vascular remodeling in rats

YUChaonan1),WANGYing1),YANShuxun2),YANGGuojie1),ZHANGYanzhou3),YANGXiaocun1),LIYuan1),SUNLina1)

1)DepartmentofGeriatrics,theFirstAffiliatedHospital,ZhengzhouUniversity；Key-DisciplinesLaboratoryofClinical-MedicineofHenan，Zhengzhou4500522)DepartmentofEndocrinologyandMetabolism,theFirstAffiliatedHospital,HenanCollegeofTraditionalChineseMedicine,Zhengzhou4500083)DepartmentofCardiology,theFirstAffiliatedHospital,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450052

Key wordshypertension；testosterone receptor；vascular remodeling；mitogen-activated protein kinase；phosphatase

doi：10.13705/j.issn.1671-6825.2015.06.004

中圖分類號R544.1

通信作者#，女，1974年6月生，博士，教授，主任醫師，研究方向：心肌重構的機制及防治，E-mail:2414714561@qq.com