甲型副傷寒沙門菌噬菌體LSPA1啟動子篩選方法的建立*

曾韋錕，毛普加，洪　愉，馮夢蝶，許澤仰，宋武戰(zhàn)，楊洪文，趙繼華,王紀愛，黃　芬，井申榮

1)昆明學(xué)院醫(yī)學(xué)院臨床檢驗教研室 昆明 650214　2)昆明理工大學(xué)醫(yī)學(xué)院病原微生物學(xué)實驗室 昆明 650500　3)成都軍區(qū)昆明總醫(yī)院核醫(yī)學(xué)科 昆明 650532

△男，1974年10月生，博士，講師，研究方向：病原微生物學(xué)，E-mail：zengweikun@126.com

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甲型副傷寒沙門菌噬菌體LSPA1啟動子篩選方法的建立*

曾韋錕1)△，毛普加2)，洪愉3)，馮夢蝶2)，許澤仰2)，宋武戰(zhàn)3)，楊洪文3)，趙繼華3),王紀愛1)，黃芬2)，井申榮2)

1)昆明學(xué)院醫(yī)學(xué)院臨床檢驗教研室 昆明 6502142)昆明理工大學(xué)醫(yī)學(xué)院病原微生物學(xué)實驗室 昆明 6505003)成都軍區(qū)昆明總醫(yī)院核醫(yī)學(xué)科 昆明 650532

△男，1974年10月生，博士，講師，研究方向：病原微生物學(xué)，E-mail：zengweikun@126.com

關(guān)鍵詞甲型副傷寒沙門菌；噬菌體；啟動子

摘要目的：通過構(gòu)建pCAT3啟動子陷阱載體篩選甲型副傷寒沙門菌噬菌體LSPA1啟動子。方法：PCR無義突變?nèi)コ齪CAT2載體骨架上CalⅠ酶切位點，并在CAT片段的5’端引入CalⅠ的酶切位點，構(gòu)建啟動子陷阱載體pCAT3。TaqⅠ酶切噬菌體LSPA1基因組，插入pCAT3載體中，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α，通過氯霉素抗性平板篩選獲得噬菌體LSPA1基因文庫菌;隨機挑取1株提取質(zhì)粒，測序及比對分析插入序列；根據(jù)分析結(jié)果設(shè)計引物,擴增可能的啟動子序列，并插入驗證載體p-3lysm-egfp，轉(zhuǎn)化DH5α，熒光顯微鏡觀察。結(jié)果：成功構(gòu)建pCAT3啟動子陷阱載體，獲得約100啟動子文庫菌，其中1株文庫菌質(zhì)粒中隨機插入片段可能對應(yīng)噬菌體LSPA1的 ORF4啟動子；插入待驗證DNA片段的p-3lysm-egfp載體重組菌在熒光顯微鏡下能見到明顯綠色熒光。結(jié)論：該啟動子文庫可有效篩選噬菌體LSPA1啟動子，為進一步深入研究噬菌體LSPA1提供幫助。

AbstractAim: To screen promoter of Salmonella paratyphi A phage LSPA1 through promoter trap vector pCAT3. Methods: CalⅠ restriction site on plasmid pCAT2 backbone was deleted by PCR nonsense mutation, and then the CAT gene with new CalⅠ on the 5′end was inserted into pCAT2 to get promoter trap vector pCAT3. The digested fragment of LSPA1 phage genome was inserted to pCAT3 and then transformed into E.coli DH5α. The bacteria phage LSPA1 promotor library was screened using plates containing chloramphenicol. After plasmid was extracted from a randomly picked bacterial, the information of inserted sequences was gained by sequencing.According to the results, primers were designed to amplify the possible promoter sequence and inserted to plasmid p-3lysm-egfp. After this plasmid was transformed into DH5α, the recombinant bacteria were observed under fluorescence microscopy. Results: Promoter trap vector pCAT3 was successfully constructed. About 100 bacteria containing promoter were gained, one of which was presumed to be ORF4 promoter of phage LSPA1. Recombinant bacteria DH5α/p-3lysm-egfp carried the insert DNA fragments was obviously observed green fluorescence under fluorescence microscope. Conclusion: This library can effectively screen phage LSPA1 promoter, which would be helpful for further research of phage LSPA1.

由傷寒和甲型副傷寒沙門菌引起的傷寒腸熱病在東南亞仍然是一個主要的衛(wèi)生健康問題[1]。流行病學(xué)調(diào)查[2]表明，每年全球傷寒腸熱病病例約為2 700萬，其中死亡病例高達20萬。在我國特別是在廣西、浙江、江蘇、貴州、云南等省份，近十幾年均有甲型副傷寒的暴發(fā)或流行[3]。臨床分離的甲型副傷寒沙門菌常表現(xiàn)出耐藥性，給治療帶來了困難。噬菌體作為細菌的殺手，可用來控制生物防控細菌的感染[4]。作者所在的實驗室在前期篩選出一株甲型副傷寒沙門菌CMCC50973烈性噬菌體LSPA1，采用鳥槍法測序獲得全基因組序列，并預(yù)測出58個開放閱讀框(ORF)。啟動子是DNA鏈上指導(dǎo)RNA聚合酶結(jié)合并起始mRNA合成的DNA序列，是控制基因表達的重要組成部位[5]。對于噬菌體而言，侵染宿主的每一步都受到精確的調(diào)控，啟動子在此扮演的角色至關(guān)重要，這些ORF編碼蛋白的表達依賴于噬菌體自身的啟動子。分析未知啟動子，除了利用生物信息學(xué)方法預(yù)測外，還可利用啟動子陷阱載體，通過構(gòu)建基因組文庫的方法進行篩選[6-7]。為了深入研究LSPA1的活動，該研究構(gòu)建CAT為報告基因的啟動子陷阱載體pCAT3，嘗試構(gòu)建噬菌體LSPA1基因組文庫的方法來篩選噬菌體LSPA1啟動子。

1材料與方法

1.1菌株與試劑甲型副傷寒沙門菌CMCC50973(實驗室保存，噬菌體LSPA1宿主菌)，噬菌體LSPA1(實驗室保存，由醫(yī)院污水中分離獲得，GenBank登錄號為KM272358[8-9])，大腸桿菌DH5α(實驗室保存，用于制備感受態(tài))，pCAT2[10](實驗室保存，以pET-28a為基礎(chǔ)，利用PCR、酶切等方法構(gòu)建的缺乏T7啟動子且含有CAT報告基因的篩選載體)，重組質(zhì)粒pET-28a-3lysm-egfp[實驗室構(gòu)建保存。將3lysm-egfp(約1 500 bp)用XhoⅠ/NdeⅠ雙酶切構(gòu)建到pET-28a載體上，并測序驗證]。3lysm是一種錨定序列，能將融合蛋白錨定到乳酸菌細胞壁上[11]。DNA Marker DL5000購自大連寶生物工程公司，卡那霉素(K+，50 mg/L)、氯霉素(Chl+，20 mg/L)、PCR試劑均購自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司，TransStart FastPfu Fly DNA Polymerase(FPfu)購自北京全式金生物技術(shù)有限公司。實驗中所用引物均由上海捷瑞生物工程有限公司合成(表1)。

表1　實驗中所用引物

F：上游引物；R：下游引物；單下劃線：酶切位點；雙下劃線：RBS。

1.2啟動子陷阱載體pCAT3的構(gòu)建及自激活驗證根據(jù)pCAT2 K+基因中CalⅠ的酶切位點設(shè)計pCAT2m-F和pCAT2m-R突變引物，擴增pCAT2全長，轉(zhuǎn)化至DH5α，提取轉(zhuǎn)化子質(zhì)粒，用CalⅠ酶切鑒定，突變成功后的載體命名為pCAT2m；設(shè)計引物CAT(pCAT2m)-F和CAT(for pER-MR)-R，擴增CAT基因，在其5’端引入BamHⅠ和CalⅠ，下游引入XhoⅠ，PCR產(chǎn)物經(jīng)BamHⅠ、XhoⅠ雙酶切pCAT2m載體，鑒定正確后命名為pCAT3，并用NdeⅠ/XhoⅠ雙酶切鑒定。將構(gòu)建的pCTA3/DH5α在Chl+(20 mg/L)平板中劃線，37 ℃培養(yǎng)過夜，觀察pCTA3是否能夠生長。

1.3噬菌體LSPA1基因文庫的建立噬菌體LSPA1基因組的提取：取100 mL噬菌體LSPA1，加入1 mg/L DNaseⅠ和RNase，37 ℃靜置30 min；再加入58.4 g/L NaCl，冰水浴1 h后離心，收集上清；加入100 g/L PEG8000，充分溶解后冰水浴1 h，離心，棄上清，加入2 mL TE重懸；加入等體積的氯仿混勻，離心，收集上清，重復(fù)一次；加入終質(zhì)量濃度5 mg/L DNaseⅠ和1 mg/L RNase，37 ℃溫育1 h；加入終質(zhì)量濃度1 mg/L EDTA(pH 8.0)、50 mg/L 蛋白酶K、5.0 g/L SDS混勻，56 ℃溫育1 h，加入等體積的酚(pH 8.0)混勻，離心，收集上清水相，再加入等體積氯仿混勻，離心，收集上清水相；將上清水相進行乙醇沉淀回收即為噬菌體LSPA1基因組。

取1 μg噬菌體基因組、0.5 μLTaqⅠ、1 μL Buffer，ddH2O補至10 μL，37 ℃酶切30 min；加90 μL ddH2O補至100 μL，乙醇沉淀全基因回收。將構(gòu)建的pCAT3用CalⅠ單酶切，切膠回收，并去磷酸化，再和噬菌體酶切片段連接、轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)。用pCAT-Cexu-R和Cexu-F驗證插入片段大小。

1.4測序及比對挑選上面獲得的文庫菌，抽提質(zhì)粒測序，并與噬菌體LSPA1基因比較分析。

1.5啟動子表達重組質(zhì)粒的構(gòu)建根據(jù)比對和LSPA1注釋結(jié)果，設(shè)計引物gp4-P-R和gp4-P-F，擴增疑似ORF4啟動子；將其與pCAT3分別用BamHⅠ/HindⅢ雙酶切，切膠回收，連接構(gòu)建重組質(zhì)粒p-4-CAT3，并轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)中，挑取單菌，提取質(zhì)粒用BamHⅠ/HindⅢ雙酶切鑒定。將重組p-4-CAT質(zhì)粒和pET-28a-3lysm-egfp用XhoⅠ/NdeⅠ雙酶切，分別回收3lysm-egfp和p-4載體，在T4連接酶作用下連接構(gòu)建p-4-3lysm-egfp，XhoⅠ/NdeⅠ雙酶切鑒定。

1.6重組菌的表達及熒光觀察取1 mL新鮮培養(yǎng)鑒定正確的重組菌p-4-3lysm-egfp/DH5α菌液(D595 nm約為0.6)，10 000g離心1 min，棄上清，沉淀用ddH2O重懸洗滌3次，稀釋100倍后，取1滴于載玻片上，晾干，于熒光顯微鏡下觀察熒光，以重組菌pCAT3-3lysm-egfp/DH5α為陰性對照。

2結(jié)果

2.1啟動子陷阱載體pCAT3的構(gòu)建及自激活驗證結(jié)果見圖1。擴增pCAT2質(zhì)粒全長(圖1A)；利用點突變方法無義突變pCAT2質(zhì)粒K+抗性基因中CalⅠ酶切位點(圖1B)，點突變后質(zhì)粒不能被CalⅠ酶切，點突變成功。設(shè)計合成引物擴增CAT基因，并在前端添加CalⅠ酶切位點，替換點突變pCAT中CAT基因，重組pCAT3能夠被CalⅠ酶切，并且NdeⅠ/XhoⅠ雙酶切出理論大小的CAT基因，證明篩選載體pCAT3改造成功(圖1C和D)；將構(gòu)建成功的pCAT3于Chl+平板中劃線，pCAT3不能在Chl+平板中生長，表明pCAT3無自激活現(xiàn)象。A：PCR擴增pCAT2全長；1：Marker；2：pCAT2全長。B：pCAT2無義突變鑒定圖；1：Marker；2：pCAT2無義突變CalⅠ酶切；3：pCAT2原始質(zhì)粒。C：pCAT3CalⅠ酶切鑒定圖；1：Marker；2：pCAT3CalⅠ酶切；3：pCAT3原始質(zhì)粒。D：pCAT3NdeⅠ/XhoⅠ雙酶切鑒定圖；1：Marker；2：pCAT3NdeⅠ/XhoⅠ雙酶切；3：pCAT3原質(zhì)粒。

圖1　啟動子陷阱載體pCAT3的構(gòu)建結(jié)果

2.2噬菌體LSPA1基因文庫的構(gòu)建結(jié)果將提取的噬菌體LSPA1基因用TaqⅠ酶切(圖2左)，乙醇沉淀全基因組回收，并構(gòu)建到pCAT3載體上，在Chl+平板中成功篩選出啟動子；挑取10株單菌，PCR驗證(圖2右)，并測序；將測序結(jié)果提交NCBI與LSPA1基因比對，證明插入片段為噬菌體LSPA1基因片段。

圖2　噬菌體LSPA1基因文庫的構(gòu)建結(jié)果

左：噬菌體LSPA1基因組酶切圖；1：Marker；2：噬菌體LSPA1基因組酶切。右：啟動子隨機菌株P(guān)CR鑒定；1：Marker；2~11：隨機10株啟動子單菌PCR。

2.3啟動子表達重組質(zhì)粒的構(gòu)建結(jié)果設(shè)計引物，擴增ORF4上游啟動子片段并酶切構(gòu)建到pCAT3載體上，BamHⅠ/HindⅢ雙酶切鑒定重組質(zhì)粒p-4-CAT3(圖3左)，酶切出149 bp大小的啟動子片段，與理論相符；將重組表達載體p-4-3lysm-egfp用XhoⅠ/NdeⅠ雙酶切鑒定(圖3右)，酶切產(chǎn)物為1 700 bp大小片段，證明重組表達載體構(gòu)建成功。

圖3　啟動子表達重組質(zhì)粒的構(gòu)建結(jié)果

左：重組質(zhì)粒p-4-CAT3雙酶切鑒定；1：Marker；2：p-4-CAT3雙酶切。右：重組質(zhì)粒p-4-3lysm-egfp雙酶切鑒定；1：Marker；2：p-4-3lysm-egfp雙酶切。

2.4重組菌的表達及熒光觀察結(jié)果取1滴新鮮的構(gòu)建成功的重組表達菌p-4-3lysm-egfp/DH5α于載玻片上，熒光顯微鏡觀察，重組表達菌有熒光產(chǎn)生，陰性對照p-3lysm-egfp/DH5α重組菌無熒光。

3討論

噬菌體LSPA1是甲型副傷寒沙門菌烈性噬菌體。噬菌體的感染周期一般分為早期、中期、晚期3個時期，其中早期主要轉(zhuǎn)錄RNA聚合酶，中期編碼調(diào)節(jié)因子，而晚期主要是完成噬菌體DNA復(fù)制、裝配、以及宿主菌的裂解[12]，每個時期都由相對應(yīng)的啟動子發(fā)揮作用，為了更深入研究噬菌體的生命活動，篩選其啟動子并鑒定具有重要的意義。

篩選和檢測啟動子的方法可利用缺乏啟動子的報告基因構(gòu)建陷阱載體，該研究選擇常用的CAT基因作為報告基因。在研究之前作者發(fā)現(xiàn)pET-28a中T7啟動子能夠本底啟動CAT基因的表達，所以為了實驗的進行，首先將pET-28a進行改造獲得無T7啟動子的pCAT重組載體。在對噬菌體LSPA1基因進行酶切分析時發(fā)現(xiàn)，雖然Sau3AⅠ與TaqⅠ一樣也是識別4堿基，但是Sau3AⅠ在LSPA1基因組分布不如TaqⅠ廣泛，因此該研究采用TaqⅠ酶切基因組，而不是最常用的Sau3AⅠ酶切。與TaqⅠ配套使用的同位酶是CalⅠ，由于pCAT2載體在K+基因上有一個CalⅠ酶切位點，為此作者先利用PCR方法將K+基因CalⅠ酶切位點的A堿基突變成T堿基，無義突變掉CalⅠ位點；同時為了在CAT前插入TaqⅠ酶切的片段，又重新擴增CAT基因并在5’端添加CalⅠ酶切位點，從而獲得新的啟動子陷阱載體pCAT3。

將LSPA1酶切插入pCAT3后轉(zhuǎn)化DH5α，通過氯霉素抗性即可簡單獲得LSPA1啟動子文庫菌，從文庫菌質(zhì)粒PCR鑒定的結(jié)果看，插入片段具有一定的多樣性，從插入片段測序分析結(jié)合LSPA1測序結(jié)果，作者選定ORF4上游插入片段進一步驗證。考慮到啟動子片段的大小，選擇性擴增了大小約149 bp的片段。同時為了方便觀察啟動子活性并進一步驗證，作者選擇實驗室前期構(gòu)建的pET-28a-3lysm-egfp，將擴增片段插入3lysm-egfp上游，攜帶該質(zhì)粒的重組菌在熒光顯微鏡下能夠發(fā)出綠色熒光，表明該片段的確具有啟動子功能。

總之，該研究成功地通過啟動子陷阱載體獲得了LSPA1啟動子文庫菌，為深入研究LSPA1生命活動以及與宿主的相互作用奠定了基礎(chǔ)，但是以大腸桿菌DH5α作為篩選宿主，可能會影響噬菌體LSPA1啟動子識別，因此下一步研究仍需要以甲型副傷寒沙門菌作為宿主。

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(2015-01-20收稿責(zé)任編輯趙秋民)

*國家自然科學(xué)基金項目U1204807；河南省科技廳科技攻關(guān)項目340600531525；河南省醫(yī)學(xué)科技攻關(guān)項目201304013

Establishment of a method to screen promoter ofSalmonellaparatyphiA phage LSPA1

ZENGWeikun1),MAOPujia2),HONGYu3),FENGMengdie2),XUZeyang2),SONGWuzhan3),YANGHongwen3),ZHAOJihua3),WANGJi′ai1),HUANGFen2),JINGShenrong2)

1)DepartmentofClinicalLaboratory,MedicalFaculty,KunmingUniversity,Kunming6502142)LaboratoryofPathogenyBiology,MedicalFaculty,KunmingUniversityofScienceandTechnology,Kunming6505003)DepartmentofNuclearMedicine,KunmingGeneralHospitalofChengduMilitaryCommand,Kunming650532

Key wordsSalmonella paratyphi A; phage; promoter

doi：10.13705/j.issn.1671-6825.2015.06.005

中圖分類號Q939.48；R378.2