豫醫卷毛大鼠Krt71基因cDNA序列的比較生物學分析*

張明昊，章金濤

1)河南中醫學院基礎醫學院醫學機能實驗室 鄭州 450046　2)鄭州大學實驗動物中心 鄭州 450052

△男，1982年7月生，碩士，實驗師，研究方向：動物遺傳學，E-mail:zhangminghao@139.com

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豫醫卷毛大鼠Krt71基因cDNA序列的比較生物學分析*

張明昊1)△，章金濤2)

1)河南中醫學院基礎醫學院醫學機能實驗室 鄭州 4500462)鄭州大學實驗動物中心 鄭州 450052

△男，1982年7月生，碩士，實驗師，研究方向：動物遺傳學，E-mail:zhangminghao@139.com

關鍵詞卷毛大鼠；Krt71基因；同源性比較

摘要目的：對豫醫卷毛大鼠的Krt71基因進行比較生物學分析。方法：采用PCR方法對豫醫卷毛大鼠Krt71的cDNA序列進行克隆、測序，并與BN大鼠、小家鼠、家牛、家綿羊、家貓、蘇門答臘猩猩和人的Krt71 cDNA序列及其編碼產物的氨基酸序列進行同源性比較和系統遺傳學分析。結果：獲得了豫醫卷毛大鼠Krt71基因全長1 573 bp的cDNA序列(GenBank登錄號：KF303588)。豫醫卷毛大鼠與BN大鼠、小家鼠、家牛、家綿羊、家貓、蘇門答臘猩猩和人的同源性分別為99.9%、95.2%、88.5%、87.5%、88.0%、88.1%、88.1%，氨基酸序列的同源性分別為99.9%、98.9%、92.4%、91.2%、91.4%、92.3%、92.1%。結論：Krt71基因在哺乳動物進化過程中具有較高的保守性，是一個具有重要功能的“持家基因”。

AbstractAim: To study the difference of Keratin 71(Krt71) gene and its coding between Yuyi curly hair rats and other species. Methods: PCR technique was developed to clone the sequence of cDNA of Krt71 gene from Yuyi curly hair rats, and biologic characters of nucleotide and amino acid sequence encoding Krt71 gene in different species ( rattus norvegicus, mus musculus, bos taurus, ovis aries, felis catus, pongo abelii and homo sapiens) were analyzed. Results: A full-length cDNA of Yuyi curly hair rats was 1 573 bp(Accession Number:KF303588).The Krt71 gene nucleotide homology of Yuyi curly hair rats to rattus norvegicus, mus musculus, bos taurus, ovis aries, felis catus, pongo abelii,and homo sapiens was 99.9%,95.2%,88.5%,87.5%,88.0%,88.1% and 88.1%,and those of amino acid sequences was 99.9%,98.9%,92.4%,91.2%,91.4%,92.3% and 92.1%,respectively. Conclusion: A high degree of conservation of Krt71 gene exists among different mammalian taxons, and Krt71 gene is an important housekeeping gene.

角蛋白是在上皮細胞發生、分化與成熟的過程中逐漸形成的一種不溶于水的蛋白質。它作為外胚層細胞的結構蛋白廣泛存在于生物體的組織結構中[1]。毛發是由毛囊長出的纖維化蛋白，其主要成分為角蛋白。目前已經發現了40多種角蛋白基因，它們的正確表達及角蛋白網功能的正常是表皮細胞穩定和正常分化的基礎[2]，而這些基因的突變可造成角蛋白結構異常，進而產生毛發缺陷疾病，如人類念珠形發和脫發等。根據組成的氨基酸不同，角蛋白可以分為酸性角蛋白(Ⅰ型)和中性、堿性角蛋白(Ⅱ型)兩種。在組裝時，只有Ⅰ型和Ⅱ型角蛋白以等比例混合組成異二聚體，才能進一步形成中間纖維。Ⅱ型角蛋白Krt71基因(Keratin 71 gene，也稱Krt 2-6g或mK6irsl)特異表達于毛囊內根鞘(Inner root sheath, IRS)[3]，該基因的突變會影響毛發的正常生長發育。豫醫卷毛大鼠(Yuyi curly hair rat, YCHR)是一種被毛和胡須均發生彎曲的基因突變大鼠，經遺傳測交實驗證實該卷毛性狀受常染色體上單一顯性基因控制，呈現半顯性遺傳[4-6]。YCHR現已在突變體的基礎上育成分離近交系，并證明YCHR的卷毛性狀是由Krt71基因cDNA序列的420-422位3個堿基(CAA)缺失引起的。由此可見，Krt71基因是毛發生長發育過程中的重要基因之一，對其進行深入研究將有助于了解該基因在生物體生長發育過程中的作用，進一步揭示毛發卷曲及波紋狀性狀產生的機制。作者同時克隆了YCHR Krt71基因的cDNA序列，并與GenBank上發布的其他物種的Krt71基因cDNA序列進行了同源性比較，旨在進一步探討Krt71基因的同源性及其比較生物學特征。

1材料與方法

1.1實驗動物8周齡YCHR 10只，雌雄各半，由鄭州大學實驗動物中心提供，一級環境條件下飼養。

1.2主要試劑Taq DNA聚合酶、10×PCR Buffer、100 mmol/L Tris-HCl(pH 8.8)、500 mmol/L KCl，MgCl2(25 mmol/L)、dNTP(10 mmol/L)、DNA Marker、6×DNA Loading Dye，SK1261 DNA提取試劑盒、PCR產物純化回收試劑盒等均購自上海生工生物工程技術服務公司。

1.3DNA的提取處死YCHR后立即取腦組織，用液氮速凍后貯存于-196 ℃液氮罐中，用DNA提取試劑盒提取總DNA，保存于-80 ℃冰箱中待用。

1.4引物的設計及合成根據GenBank上發表的大鼠Krt71基因的DNA序列(GenBank登錄號：AAHX01052752)和cDNA序列(GenBank登錄號：NM001276440)，采用DNAStar軟件包的PrimerSelect程序設計了8對重疊引物(表1)，用以擴增YCHR Krt71基因cDNA序列。引物由上海生工生物工程技術服務公司合成。

表1　擴增Krt71基因cDNA序列所用引物

1.5PCR擴增反應體系：模板DNA 1 μL，上、下游引物各1 μL，10 mmol/L dNTP 1 μL，Taq Buffer 5 μL，25 mmol/L MgCl25 μL，5 U/μL Taq DNA聚合酶0.5 μL，dH2O 35.5 μL，總體系為50 μL。反應條件：95 ℃預變性3 min，94 ℃變性45 s，56~60 ℃退火35 s，72 ℃延伸50~90 s進行35個循環，最后72 ℃修復延伸8~10 min，4 ℃保存。

1.6測序PCR擴增產物在10 g/L瓊脂糖凝膠中進行電泳檢測，將有目的條帶的PCR產物送上海生工生物工程技術服務公司雙向測序。

1.7Krt71基因cDNA序列和氨基酸序列分析將獲得的cDNA序列在GenBank上進行BLAST初步比對分析，然后再根據序列重疊區域拼接YCHR Krt71基因cDNA完整序列，并下載BN大鼠(GenBank登錄號：NM001276440)、小家鼠(GenBank登錄號：NM019956)、家貓(GenBank登錄號：NM001195239)、家綿羊(GenBank登錄號：JX975451)、家牛(GenBank登錄號：NM001075970)、蘇門答臘猩猩(GenBank登錄號：NM001131706)和人(GenBank登錄號：NM033448)的Krt71基因cDNA序列，采用DNAMAN和DNAStar軟件進行同源性比對和系統遺傳學分析。

2結果

2.1YCHR Krt71基因cDNA的克隆PCR產物經10 g/L瓊脂糖凝膠電泳鑒定，結果均得到明顯特異性的目的條帶，產物大小與預期結果相一致(圖1)。測序結果在GenBank上經BLAST比對分析，確認結果為Krt71基因序列。序列拼接顯示YCHR Krt71基因的完整cDNA序列長1 573 bp(GenBank登錄號：KF303588)，在420～422處缺失了3個堿基，比正常SD大鼠的Krt71基因cDNA序列1 575 bp少了3個堿基。

圖1　YCHR Krt71基因PCR電泳結果

2.2Krt71基因的比較生物學分析系統遺傳分析(DNAMAN)結果見圖2。同源性分析結果見表2、3。Krt71基因的系統遺傳分析結果顯示YCHR與BN大鼠處于一個分支，和小家鼠的親緣關系較近，家綿羊和家牛、人和蘇門答臘猩猩分別處于另外的獨立分支。雖然相距較遠，但也有80%的同源性。

圖2　Krt71基因同源序列的進化分析

動物編號123456781100.099.995.288.587.588.088.188.1299.9100.092.877.676.377.278.278.2395.292.8100.077.175.976.778.378.4488.577.677.1100.088.088.485.985.8587.576.375.988.0100.097.284.984.8688.077.276.788.497.2100.085.285.1788.178.278.385.984.985.2100.099.8888.178.278.485.884.885.199.8100.0

1：YCHR； 2：BN大鼠(NM001276440)；3：小家鼠(NM019956)；4：家貓(NM001195239)；5：家綿羊(JX975451)；6：家牛(NM001075970)；7：蘇門答臘猩猩(NM001131706)；8：人(NM033448)。

表3　YCHR與其他物種

1：YCHR； 2：BN大鼠(NP001263369)；3：小家鼠(NP064340)；4：家貓(NP001182168)；5：家綿羊(AFV46425)；6：家牛(NP001069438)；7：蘇門答臘猩猩(NP001125178)；8：人(NP258259)。

3討論

研究毛發的形成及基因型與表現型的關系需要借助自發的或誘導的多種毛發缺陷動物，在某些情況下，這些研究還能幫助人們揭示脫發及毛發異常的原因[7]。角蛋白基因集中存在于鼠類的11號(Ⅰ型角蛋白基因)和15號(Ⅱ型角蛋白基因)染色體的遠端。大鼠Ⅱ型角蛋白Krt71基因編碼產物由524個氨基酸組成，其中130個氨基酸組成頭部，310個氨基酸組成α-螺旋桿，84個氨基酸組成尾部。Krt71蛋白的α-螺旋桿在Ⅰ型、Ⅱ型角蛋白相互作用組成異二聚體的過程中發揮了重要的作用[8]。Krt71基因特異表達于毛囊內根鞘，如發生基因突變將會直接影響到其編碼蛋白的α-螺旋桿的形成，進而影響到毛囊內根鞘的形態，最終導致機體毛發卷曲，如CaRin、CaJ、Rcol12和Rcol13等[7-8]，Krt71基因的單核苷酸多態性(single nucleotide polymorphism，SNP)導致的改變也會使貓和狗的毛發卷曲[9-11]。YCHR Krt71基因的cDNA序列為1 573 bp，在420～422處缺失了3個堿基，這種突變導致Krt71蛋白的第140位天冬酰胺缺失，由于該缺失位于Krt71蛋白的α-螺旋桿內，可能是導致卷毛性狀出現的原因。為了深入了解Krt71基因組成的差異，作者克隆了Krt71基因cDNA序列共計1 573 bp，該基因編碼的蛋白質由523個氨基酸殘基組成。在此基礎上，作者對包括YCHR在內的7個物種的8條Krt71基因的cDNA序列及其編碼蛋白的氨基酸序列進行了同源性分析，發現YCHR Krt71基因同GenBank上發布的BN大鼠、小家鼠、家牛、家綿羊、家貓、蘇門答臘猩猩和人的同源性分別為99.9%、95.2%、88.5%、87.5%、88.0%、88.1%、88.1%，氨基酸序列的同源性分別為99.9%、98.9%、92.4%、91.2%、91.4%、92.3%、92.1%，表明該基因在哺乳動物中具有高度的保守性，是一個具有重要功能的“持家基因”。近年來有報道[12]指出，對某些高度保守的單分子系統進化的分析與研究能夠更為簡便有效地揭示出某些蛋白質的結構和功能，亦是研究相應物種基因組水平的重要證據和線索。因此，進一步分析Krt71基因及其編碼蛋白，發現該基因在人類與各種模式生物之間功能上的異同點，可以把來源于不同模式生物的Krt71基因作為人類Krt71基因的天然突變體，用于進一步研究該基因及其編碼蛋白的結構和功能。

綜上所述，作者克隆并獲得了YCHR Krt71基因cDNA的完整序列，該序列已提交給GenBank，并通過對不同物種Krt71基因cDNA序列及其編碼產物氨基酸序列的同源性比較，初步了解了Krt71基因在物種進化上的同源性和保守性，為今后進行Krt71基因的多態性檢測及開展Krt71基因與毛發生長發育和YCHR某些性狀的相關性研究提供了基礎性資料。

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[12]章金濤,張明昊,王純耀.豫醫卷毛大鼠表皮生長因子受體基因的比較生物學分析[J].鄭州大學學報:醫學版,2011,46(3):351

*“十二·五”科技重大專項課題資助2014ZX10003002；河南省科技攻關項目資助122102310053

Comparative biology analysis of Krt71 gene in Yuyi curly hair rats

ZHANGMinghao1),ZHANGJintao2)

1)MedicalScienceFunctionLaboratory,SchoolofBasicMedicine,HenanUniversityofTraditionalChineseMedicine,Zhengzhou4500462)LaboratoryAnimalCenter,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450052

Key wordscurly hair rat; Krt71 gene; homology comparison

doi：10.13705/j.issn.1671-6825.2015.06.008

中圖分類號Q953