雙熒光素酶報告基因系統檢測CYP3A4*1G增強CYP3A4表達的調控作用*

楊衛紅, 閆　良, 劉利娥, 趙登職, 張　衛, 張莉蓉#

1)鄭州大學基礎醫學院法醫學系 鄭州 450001　2)鄭州大學基礎醫學院藥理學系 鄭州 450001　3)鄭州大學公共衛生學院衛生化學與衛生檢驗系 450001　4)鄭州頤和醫院藥學部 鄭州 450047　5)鄭州大學第一附屬醫院麻醉科 鄭州 450052

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雙熒光素酶報告基因系統檢測CYP3A4*1G增強CYP3A4表達的調控作用*

楊衛紅1), 閆良2), 劉利娥3), 趙登職4), 張衛5), 張莉蓉2)#

1)鄭州大學基礎醫學院法醫學系 鄭州 4500012)鄭州大學基礎醫學院藥理學系 鄭州 4500013)鄭州大學公共衛生學院衛生化學與衛生檢驗系 4500014)鄭州頤和醫院藥學部 鄭州 4500475)鄭州大學第一附屬醫院麻醉科 鄭州 450052

關鍵詞CYP3A4*1G;CYP3A4啟動子;雙熒光素酶報告基因;轉錄調控

摘要目的：探討CYP3A4*1G增強CYP3A4基因表達的負調控作用。方法：設計合成包含CYP3A4*1G G或A等位基因的一系列基因片段(外顯子10與內含子10交界處287和181 bp)，構建CYP3A4*1G正向位于CYP3A4啟動子上游的熒光素酶報告基因載體，與內參質粒pRL-TK共轉染HepG2細胞，通過雙熒光素酶報告基因系統檢測熒光素酶活性。結果：與CYP3A4啟動子相比較， G與A等位基因在287 bp DNA片段中均降低了熒光素酶表達(F=795.575，P<0.001)，且G與A等位基因對CYP3A4啟動子活性的抑制程度比較差異無統計學意義(P>0.05)。與CYP3A4啟動子相比較，G與A等位基因在181 bp DNA片段中均降低了熒光素酶表達(F=23.218，P<0.001)，而G與A等位基因對CYP3A4啟動子活性的抑制程度比較差異無統計學意義(P>0.05)。結論：在CYP3A4內含子10與外顯子10交界處CYP3A4*1G存在與CYP3A4*1G變異無關的CYP3A4啟動子的抑制元件，該抑制元件對CYP3A4*1G增強CYP3A4基因表達起負調控作用。

AbstractAim: To study the negative regulation of CYP3A4*1G enhancing CYP3A4 gene expression．Methods: A series of reporter gene vectors carrying CYP3A4*1G G or A allele in different length DNA fragments(exon-intron junction,287 or 181 bp) located upstream of the CYP3A4 promoter in the forward direction were constructed. The above recombinant plasmids were co-transfected with internal control plasmid pRL-TK into HepG2 cells by LipofectamineTM2000, and luciferase activity was measured with dual luciferase reporter gene system.Results: Compared with CYP3A4 promoter, the G allele and the A allele in 287 bp DNA fragments both decreased the expression of luciferase(F=795.575,P<0.001),while there was no significant difference in the degree of inhibition to CYP3A4 promoter by the both alleles(P>0.05). Compared with CYP3A4 promoter, the G allele and the A allele in 181 bp DNA fragments both reduced the expression of luciferase(F=23.218, P<0.001), while there was no difference in the extent of inhibition to CYP3A4 promoter by the both alleles(P>0.05).Conclusion: There is a certain inhibition element independent on CYP3A4*1G variation of the CYP3A4 promoter，lying exon-intron 10 junction of CYP3A4,and it has negative regulation to CYP3A4*1G enhancing CYP3A4 expression.

藥物代謝酶CYP3A4可代謝一半以上的常用臨床藥物，編碼該酶的基因的單核苷酸多態性(single nucleotide polymorphisms,SNP)是引起CYP3A4藥物反應個體差異的主要因素。CYP3A4*1G是CYP3A4內含子10中的一個SNP，在中國漢族人群中等位基因頻率高達20%以上[1-2]；體內研究[2-7]表明該SNP與CYP3A4代謝的多種藥物的療效密切相關，且該課題組前期研究[8]結果表明CYP3A4*1G以等位基因依賴方式調控CYP3A4內含子10增強子活性，從而增強CYP3A4的表達。CYP3A4基因不止一個增強子，如5’端增強子及被CYP3A4*1G調控的內含子10增強子，作者推測前者發揮作用時后者可能會受到抑制元件的調控，在該研究中作者采用雙熒光素酶報告基因方法探討CYP3A4*1G增強基因表達的調控作用，報道如下。

1材料與方法

1.1主要試劑與細胞限制性內切酶KpnⅠ-HF和MluⅠ(NEB公司)，T4 DNA連接酶、PCR試劑盒及引物合成(TaKaRa公司)，質粒提取試劑盒(天根生化科技北京有限公司)；LipofectamineTM2000(Invitrogen公司)；大腸桿菌DH5α(鄭州大學基礎醫學院藥理學教研室凍存)；HepG2細胞株(上海中科院細胞研究所)；pRL-TK質粒、雙熒光素酶報告基因分析系統(Promega公司)。攜帶CYP3A4啟動子的pGL3載體(即CYP3A4 pro)由課題組前期構建。

1.2載體構建與鑒定根據CYP3A4基因(AF280107)在外顯子10與內含子10交界處分別設計2對引物(表1)，以人的基因組DNA(CYP3A4*1G GG/AA)為模板，利用PCR分別擴增CYP3A4*1G等位基因287和181 bp兩種長度的DNA片段。PCR擴增體系(50 μL)如下：2×PrimeSTAR?Max Premix 25 μL，10 μmol/L上、下游引物分別為3 μL, 模板DNA 4 μL，超純水15 μL。PCR反應條件：98 ℃ 10 s，60 ℃ 15 s，72 ℃ 120 s，循環35次。目的基因片段經KpnⅠ-HF和MluⅠ雙酶切、膠回收后，與雙酶切的質粒CYP3A4 pro經T4 DNA連接酶于16 ℃連接過夜。將連接產物轉化大腸桿菌DH5α，氨芐青霉素耐藥抗性篩選，對初步篩選出CYP3A4*1G正向位于CYP3A4啟動子上游的熒光素酶報告基因載體的陽性重組菌經質粒小提后用KpnⅠ-HF和MluⅠ雙酶切鑒定。質粒送Invitrogen公司測序。按照質粒提取試劑盒說明書提取質粒備用。

表1　PCR引物、限制性內切酶及PCR擴增產物大小

下劃線表示限制性內切酶酶切位點。

1.3細胞培養和轉染實驗HepG2細胞用含體積分數10%小牛血清及青霉素和鏈霉素的DMEM培養基于37 ℃、體積分數5% CO2條件下傳代培養。將上述重組質粒及對照質粒與內參質粒pRL-TK按照LipofectamineTM2000說明書進行細胞轉染，收集轉染后48 h的細胞進行熒光素酶活性測定。實驗重復4次。

1.4雙熒光素酶活性測定按照Promega公司提供的雙熒光素酶報告基因分析系統說明書進行操作。除去細胞培養基，PBS沖洗細胞，加入PLB細胞裂解液100 μL，室溫輕緩晃動培養板15 min后再吹打細胞，收集細胞裂解液，通過生物化學發光分析儀(德國Berthold公司)進行雙熒光素酶活性測定。以螢火蟲熒光素酶的活性與海腎熒光素酶活性的比值表示被檢測的質粒在轉染細胞后所測得的熒光素酶的相對活性。實驗重復4次。

1.5統計學處理采用SPSS 11.0進行數據分析。3組相對熒光素酶活性的比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗。檢驗水準α=0.05。

2結果

2.1重組質粒的鑒定及測序將篩選出的陽性重組質粒測序結果與目的片段序列比對，測序結果正確，測序圖分別見圖1及圖2。

圖1　含287 bp目的DNA片段的重組質粒測序圖

圖2　含181 bp目的DNA片段的重組質粒測序圖

2.2雙熒光素酶活性測定結果CYP3A4*1G等位基因在287 bp DNA片段中的雙熒光素酶活性測定結果見表2。與CYP3A4啟動子相比較，G與A等位基因均降低了熒光素酶的表達。

CYP3A4*1G等位基因在181 bp DNA片段中的雙熒光素酶活性測定結果見表3。與CYP3A4啟動子相比較，G與A等位基因均降低了熒光素酶的表達。

表2　CYP3A4*1G等位基因在

F=795.575，P<0.001；*：與CYP3A4啟動子相比，P<0.05。

表3　CYP3A4*1G等位基因在

F=23.218，P<0.001；*：與CYP3A4啟動子相比，P<0.05。

3討論

雙熒光素酶報告基因方法在研究基因調控(如增強子、內含子增強子及基因的負調控等)中具有獨特的優勢[8-12]。作者前期的雙熒光素酶報告基因系統研究[8]結果表明，CYP3A4內含子10全長具有增強子功能，且此功能被CYP3A4*1G等位基因依賴性調控，由于轉錄后的前體CYP3A4 RNA在形成mRNA時內含子10全長被切除，推測此被切除后的內含子10全長可作為一個整體獨立發揮功能。為驗證CYP3A4*1G增強基因表達的負調控作用，作者通過構建CYP3A4*1G等位基因位于內含子與外顯子交界處的287及181 bp DNA片段的熒光素酶載體轉染HepG2細胞，發現CYP3A4內含子10與外顯子10交界處存在CYP3A4啟動子的抑制元件，但該抑制元件對CYP3A4*1G增強CYP3A4基因表達起負調控作用。已有研究[13]發現，hPLP1的剪接變異體中包含了來自其內含子1的外顯子，且與增強其基因表達有關，表明內含子與外顯子并存時可影響基因表達，從理論上支持了該實驗外顯子與內含子交界處序列可影響基因表達的結果。

該研究中構建CYP3A4*1G熒光素酶載體時雖然所用的一種目的DNA的長度(287 bp)及序列與文獻[14]均一致，但該研究結果與其發現CYP3A4*1G A等位基因比G等位基因具有較強的轉錄活性不一致，主要原因是所用啟動子不同。文獻[14]所用啟動子為CMV啟動子，該研究所用啟動子為目的基因的啟動子CYP3A4啟動子。研究目的片段時所用啟動子不同，可能會出現不同的結果。例如，Pound等[15]研究目的片段功能時先用了具有CMV啟動子的載體，后來又用其目的基因啟動子進一步驗證時出現了類似情況。另外，為驗證該實驗結果的可靠性，作者又采用181 bp DNA片段進行驗證，發現CYP3A4*1G在這兩種不同長度DNA片段中的實驗結果一致，進一步支持了CYP3A4*1G在287 bp DNA片段中的結果。

綜上所述，該研究結果表明在CYP3A4內含子10與外顯子10交界處(CYP3A4*1G附近)存在CYP3A4啟動子的抑制元件，且該抑制元件對CYP3A4*1G增強CYP3A4基因表達起負調控作用。該發現為闡明CYP3A4*1G影響CYP3A4藥物代謝的體內機制提供了理論基礎，也為研究內含子SNP調控基因表達提供了新的思路。

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*河南省科技廳重點科技攻關項目142102310434

Regulation role of CYP3A4*1G enhancing CYP3A4 expression detected by dual luciferase reporter gene system

YANGWeihong1),YANLiang2),LIULi′e3),ZHAODengzhi4),ZHANGWei5),ZHANGLirong2)

1)DepartmentofForensicMedicine,CollegeofBasicMedicalSciences,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou4500012)DepartmentofPharmacy,CollegeofBasicMedicalSciences,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou4500013)DepartmentofSanitaryChemistryandHealthInspection,CollegeofPublicHealth,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou4500014)DepartmentofPharmacy,YiheHospitalofZhengzhou,Zhengzhou4500475)DepartmentofAnesthesiology,theFirstAffiliatedHospital,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450052

Key wordsCYP3A4*1G;CYP3A4 promoter;dual luciferase reporter gene;transcriptional regulation

doi：10.13705/j.issn.1671-6825.2015.06.010

中圖分類號R394-33/Q756

通信作者#，女，1964年10月生，博士，教授，研究方向：藥物基因組學，E-mail:zhanglirongzzu@126.com